The inhibition of DNp63 produces specific alterations in the development of Xenopus laevis epidermis

M. GUADALUPE BARRIONUEVO, GABRIELA MARRANZINO, MANUEL J. AYBAR, CELESTE TRÍBULO

Tafí del Valle

Jornada; XXVIII Jornadas Científicas de la Asociación de Biología de Tucumán; 2011

El gen p63 cumple una importante función durante el desarrollo de la epidermis en diferentes modelos animales. En mamíferos, este factor de transcripción presenta dos promotores alternativos que generan dos tipos de isoformas (TA y DN). La isoforma transactivadora (TA) contiene un dominio transactivador amino-terminal mientras que la isoforma DNp63 pierde este dominio pero conserva el dominio de unión al ADN (DBD) y el dominio de oligomerización (OD). En Xenopus sólo se encontró la isoforma DNp63. Previamente, nuestros estudios determinaron que DNp63 se expresa en la epidermis, es regulado por la señal BMP4 y participa en la inducción epidérmica inhibiendo el desarrollo neural. Con el objetivo de desarrollar herramientas moleculares que permitan evaluar la función de DNp63 y obtener datos acerca de la relación estructura-función se construyó una proteína quimérica truncada en el extremo carboxilo-terminal y fusionada a GFP (DNp63(Ct)-GFP). Esta versión de DNp63 no posee el dominio de oligomerización (OD) por lo que podría actuar como una forma dominante negativa. Se verificó mediante microscopía de fluorescencia que DNp63(Ct)-GFP se expresa in vivo y mediante “western blotting” se demostró que su expresión se inhibe por el oligonucléotido tipo morfolino DNp63MO. Se procedió a analizar el rol in vivo de DNp63(Ct)-GFP mediante sobrexpresión de ARNm. Al microinyectar embriones con DNp63(Ct)-GFP se observó una disminución en la expresión del marcador epidérmico XK81a y un incremento de los genes marcadores neurales (FoxD3 y Sox2) que fue dependiente de la concentración. Estos fenotipos fueron comparables al efecto knock-down producido por DNp63MO. En forma adicional, la sobrexpresión de DNp63(Ct)-GFP en tejido ectodérmico produjo la disminución de marcadores epidérmicos analizados mediante RT-PCR. Finalmente, se realizaron experimentos de rescate de fenotipos que demostraron que DNp63(Ct)-GFP inhibe específicamente a DNp63. Nuestros resultados ponen en evidencia la importancia del dominio OD para la funcionalidad de DNp63 en la regulación de sus genes blanco.