Participación de la vía PI3K/AKT/GSK-3B en la disminución del tamaño del infarto mediada por el pre y postcondicionamiento isquémico en ratas hipertensas espontáneas (SHR)

IA PÉREZ NÚÑEZ; LF GONZÁLES ARBELAEZ; JC FANTINELLI; SM MOSCA

Mar del Plata, Argentina

Congreso; LV Reunión anual de la Sociedad Argentina de investigación Clínica, Sociedad Argentina de Fisiología. XLII Reunión anual de la Sociedad Argentina de Farmacología Experimental.; 2010

Introducción El preacondicionamiento (PI) y el postacondicionamiento isquémicos (PCI) son estrategias de protección endógena, las cuales consisten en breves ciclos de isquemia-reperfusión aplicados antes (PI) o después (PCI) de un evento isquémico prolongado, dando como resultado una disminución en el tamaño del infarto. Sin embargo, los mecanismos intracelulares responsables de la cardioprotección no han sido completamente dilucidados. Resultados previos en animales normotensos muestran que existen diversas cascadas de señalización que culminan en la fosforilación de la enzima glucógeno sintetasa cinasa 3β (GSK-3β) en el residuo Ser-9. Se ha propuesto que esta fosforilación provoca una inhibición de la actividad de dicha enzima impidiendo, entre otros efectos, la apertura del poro de permeabilidad transitoria de la mitocondria (mPTP).  Diversas vías de señalización, entre las cuales están aquellas que involucran a la PI3K/Akt, son capaces de inactivar a la GSK-3β y así promover la protección del miocardio frente a la isquemia-reperfusión. Sin embargo, la participación de estos mecanismos en animales hipertensos no ha sido aún examinada. Objetivos Determinar la participación de la via PI3K/Akt/GSK-3β en el PI y PCI sobre el tamaño del infarto y el grado de apertura del mPTP en ratas hipertensas espontáneas (SHR) Obtención del corazón aislado Materiales y Métodos Los animales (SHR, PAS= 195 ± 10 mmHg, IH (PVI/PC)= 5.25 ± 0.12) se anestesiaron con pentobarbital sódico (60 mg/kg i.p.). Se abrió rápidamente el tórax, se aisló la aorta, se colocó una cánula en dicha arteria y a través de esta el corazón se colocó en un sistema de perfusión según la técnica de Langendorff (Fig 1). Determinación del tamaño del infarto El tamaño del infarto fue determinado por la técnica de tinción con trifeniltetrazolio (TTC) y expresado como porcentaje del peso del área de riesgo. Aislamiento de mitocondrias y determinación del grado de apertura del mPTP Se repitieron todos los protocolos experimentales (Fig 2) y al final del período de reperfusión los corazones fueron desmontados del sistema Langendorff, e inmediatamente homogeneizados en una solución buffer de sucrosa 0,5 M, mannitol 0,5 M y EDTA 0,1 M, para posteriormente aislar las mitocondrias por centrifugación diferencial. Una vez obtenidas la suspensiones mitocondriales, se determinó el grado de apertura del mPTP, mediante el agregado de una dosis de Cl2Ca 20 M, siguiendo el cambio de dispersión de la luz a través de un espectrofluorómetro. Una alicuota de cada suspensión fue utilizada en microscopía electrónica para evaluar la estructura mitocondrial en cada intervención (Fig 3). Determinación de la expresión de GSK-3β y Akt fosforiladas Parte del VI de todos los grupos experimentales fueron homogeneizados con buffer RIPA y  centrifugados a 12.000 rpm durante 15 minutos a 4ºC. Los sobrenadantes fueron sometidos a SDS-PAGE y luego  transferidos a una membrana PVDF, la cual fue dejada toda la noche a 4ºC con el anticuerpo anti-fosfo-GSK-3β (dilución=1:1000). Luego fue tratada con un anticuerpo secundario (dilución=1:5000). Finalmente los complejos antígeno-anticuerpo fueron visualizados y cuantificados por quimioluminiscencia. Para determinar la expresión de P-Akt, el procedimiento fue el mismo excepto que la membrana fue tratada con un anticuerpo anti P-Akt. La expresión de estas cinasas fosforiladas fue normalizada con GAPDH.  Conclusiones Estos resultados muestran que ambas intervenciones (PI y PCI) disminuyen el tamaño del infarto producido por la isquemia y reperfusión en los corazones hipertróficos de las SHR. Este efecto cardioprotector estaría relacionado a la menor formación y/o apertura del mPTP mediada por la fosforilación de GSK-3b a través de la fosforilación y activación de PI3K/Akt.