Perfil fitoquímico y evaluación de los efectos cardioprotectores de un extracto de Humulus lupulus L. (Cannabaceae): diferencias en sexo y mecanismos de acción

DIAZ, RG; CONSOLINI AE; COLAREDA G; FLORES, ML; CORDOBA, OL

Campeche (virtual)

Simposio; SIMPOSIO IBEROAMERICANO COIFFA 2022, Tema: ?Una Salud Global"; 2022

Conferencia Iberoamericana de Facultades de Farmacia (COIFFA)

INTRODUCCION: Los estrógenos endógenos poseen un rol protector cardiovascular, que se toma como base para el uso de fitoestrógenos que resultan más seguros. Aún no se conocen completamente los efectos directos de los fitoestrógenos a nivel cardíaco, particularmente en la patología del angor o en modelos experimentales de isquemia y reperfusión (I/R). Recientemente demostramos los efectos cardioprotectores de las isoflavonas de soja (IS) y de la harina de la raíz de maca, Lepidium meyenii, por administración oral subaguda en un modelo de I/R en corazones aislados de rata de ambos sexos (Colareda et al., 2021). Al evaluar el perfil fitoquímico se encontró que ambos extractos contenían genistina, genisteína, daidzeína y gliciteína (Colareda et al., 2021). En los últimos años algunas chalconas y otros flavonoides prenilados presentes en el lúpulo, Humulus lupulus L. (Cannabaceae), han recibido mucha atención por sus efectos biológicos; entre ellos la 8-prenilnaringenina que se ha caracterizado como uno de los fitoestrógenos más potentes aislados hasta ahora (Zanoli & Zavatti, 2008). OBJETIVOS: analizar si un extracto etanólico de lúpulo en administración oral subaguda produce efectos cardioprotectores en un modelo experimental de atontamiento cardíaco por I/R, si existen diferencias de sexo en dicho efecto, evaluar en parte su mecanismo de acción y caracterizar el perfil fitoquímico del extracto empleado. METODOLOGÍA: ratas Sprague Dawley de 3 a 6 meses de edad de ambos sexos fueron tratadas con una tintura de flores de lúpulo (Humulus lupulus L.) reducidas a polvo, cultivado en la localidad de El Bolsón, Patagonia Argentina, preparada por maceración en alcohol de 70°, al 10 % p/v. Una dilución al 10 % del extracto obtenido (1 % p/v) se utilizó para tratar a los animales durante 1 semana por vía oral, ad libitum. Experimentos de atontamiento cardíaco: ventrículos aislados de ratas macho (M) y hembra (F) jóvenes (Y) sin tratar (YM, n= 10; YF, n=8) y tratadas con la tintura de las flores de lúpulo (1 % p/v) (LPL-YM, n=5; LPL-YF, n=5) fueron perfundidos por la técnica de Langendorff e introducidos en un calorímetro de flujo a 37 °C. Una vez estabilizados a 3 Hz se generó un período de isquemia global de 30 min (I) seguidos de 45 min de reperfusión (R) con Krebs. Se midió simultáneamente la presión intraventricular izquierda (LVP) y el flujo de calor total (Ht). Se calculó la máxima presión desarrollada (P, mmHg), la presión diastólica (LVEDP), el flujo de calor total (mW/g), las velocidades máximas de contracción y relajación (+dP/dt y ?dP/dt) y la economía muscular total (ECO = P/Ht). Al finalizar el protocolo, algunos ventrículos fueron empleados para medir el área de infarto con cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio y otros se congelaron a -80 °C hasta el momento de determinar la fosforilación de Akt por western blot. El ventrículo izquierdo fue homogeneizado con buffer frío conteniendo 300 mM de sacarosa, 1 mM de ditiotreitol, 4 mM de EGTA, 20 mM de Tris pH 7,4, 1 % de Tritón X, 10 % de cóctel de inhibidores de proteasa, 25 μM de FNa, 1 μM de orto-vanadato sódico. Los homogenatos se incubaron en hielo y se separó el sobrenadante por centrifugación a 15000 g por 15 min a 4 ⁰C para remover2restos celulares. Se sembraron 60 μg de proteína en un gel de 8 % SDS-poliacrilamida para la electroforesis, y se realizó una transferencia a membranas de polifluoruro de vinilideno durante 2 horas aproximadamente. Las membranas se bloquearon con 10 % de leche descremada en buffer TRIS pH 7,5 + 0,1 % de Tween 20 (TBS-T) e incubaron con anticuerpo primario contra fosfo Akt y GAPDH. Luego de incubar con los correspondientes anticuerpos secundarios, las bandas proteicas fueron visualizadas por un sistema de detección de quimioluminiscencia y, luego de normalizar (fosfoAkt/GAPDH), se calculó el valor porcentual respecto a cada condición control sin tratamiento (% YM; % YF). En otro grupo de corazones de YM-LPL (n=5) se realizó perfusión con L-NAME 30 μM durante 20 minutos antes de la I/R, para inhibir a las NO-sintasas y evaluar así su rol en el efecto de LPL durante la I/R. El perfil fitoquímico del extracto se analizó químicamente y por RP-HPLC-DAD (en un equipo Waters 1525 Binnary HPLC con detector de arreglo de diodos). Para el estudio fitoquímico se utilizaron partes aéreas (pa) e inflorescencias femeninas secas (f) reducidas a polvo. Se prepararon extractos con etanol de 70° por maceración a temperatura ambiente, de las partes aéreas y de las inflorescencias. También se prepararon infusiones de ambas partes (Ipa, If). Otras porciones de las muestras se extrajeron con cloroformo. Los extractos retomados en el solvente correspondiente (etanol, agua, cloroformo según corresponda) se caracterizaron mediante reacciones cualitativas usuales para determinar los principales grupos químicos constituyentes. La determinación de perfiles cromatográficos se efectuó mediante sistemas cromatográficos analíticos planares e instrumentales (HPLC-DAD/MS para flavonoides y derivados fenólicos, CG-FID/MS para terpenos y compuestos relacionados). Análisis estadístico: los resultados se expresan como valor promedio ± SEM. Se realizaron comparaciones entre los grupos mediante two-way ANOVA con las variables tratamiento y tiempo durante I/R; para las comparaciones pareadas se aplicaron pruebas de Tukey a posteriori. Se utilizó la prueba t de Student para comparar los valores absolutos pre-isquémicos de las variables entre 2 grupos diferentes. RESULTADOS: En YM, los ventrículos aislados de ratas bajo tratamiento oral con LPL desarrollaron una menor contractilidad en la condición basal (no isquémica), 63,6±3,5 mmHg (LPL-YM) con respecto a aquellos que no recibieron tratamiento (YM: 95,2±6,3 mmHg, t-test P