INFIVE   05416
INSTITUTO DE FISIOLOGIA VEGETAL
Unidad Ejecutora - UE
congresos y reuniones científicas
Título:
SOBREEXPRESIÓN DEL MÓDULO DE UNIÓN A CARBOHIDRATOS DE LA EXPANSINA 2 DE FRAGARIA ANANASSA DUCH. EN FRAGARIA VESCA L. MEDIDA DE LA ACTIVIDAD EXPANSINA EN FRUTILLA.
Autor/es:
SIN, IGNACIO NICOLÁS; PERINI, MAURO A.; MARTINEZ, GUSTAVO ADOLFO; CIVELLO, PEDRO MARCOS
Reunión:
Jornada; 1er Jornada de Jovenes Investigadores; 2015
Resumen:
La tasa de ablandamiento de un fruto es uno de los
factores determinantes de su calidad y vida poscosecha, fenómeno íntimamente
relacionado con la firmeza del fruto y condicionado en mayor medida por la
rigidez mecánica impuesta por la pared celular [1]. Los intentos realizados
hasta el momento para controlar el ablandamiento de frutos se han centrado en
la supresión, en forma aislada, de la expresión de genes involucrados en la
degradación de la pared [2, 3]. Si bien se consigue reducir la expresión de los
genes elegidos a niveles muy bajos, la firmeza del fruto no se modifica de
manera sustancial [4, 5], lo que demuestra que el ablandamiento del fruto es un
proceso complejo que involucra la acción coordinada y secuencial de un gran
número de enzimas y otras proteínas presentes en la pared. Un aspecto común de
la estructura de la mayoría de estas especies es su organización modular, que
generalmente comprende un módulo catalítico (característico de cada enzima) y
uno de unión a carbohidratos (CBM; carbohydrate binding module; [6]). Un CBM carente
de actividad enzimática tendría la capacidad de unirse de modo específico o
promiscuo a diferentes polisacáridos presentes en la pared celular [7], dificultando de ese modo el acceso de las enzimas
activas a sus sustratos y produciendo una reducción global de la degradación de
la pared.
En el laboratorio se
cuenta con líneas transgénicas de Fragaria
vesca Hawaii 4, generadas en colaboración con el laboratorio del Dr. Kevin
Folta en la Universidad de Florida, USA. Las plantas se transformaron con una
construcción diseñada para expresar constitutivamente en pared celular el CBM
de la Expansina 2 de Fragaria ananassa
(CBM[FaExp2]) bajo el promotor 35S del virus del mosaico del coliflor. De la
primera generación de plantas se hizo extracciones de RNA, se sintetizó DNA
copia (cDNA) y se corroboró la transgénesis por medio de PCR utilizando primers
específicos tanto para el transgen cómo para los marcadores de selección
(proteína fluorescente verde [GFP] y gen de resistencia a kanamicina). Se
seleccionaron 7 líneas transgénicas, actualmente en etapa de propagación para
dar comienzo a la caracterización fenotípica, centrada principalmente en el
ablandamiento del fruto, la composición de la pared celular, la actividad de
enzimas de pared y la expresión de genes de interés.
Una
de las caracterizaciones propuestas es la medida de la actividad Expansina de
los frutos, para lo cual se puso a punto un protocolo para la medición de dicha
actividad a partir de extractos proteicos de frutos de frutilla. Se adaptó el
protocolo descripto por McQueen-Mason [8]
para su uso con un
texturómetro comercial (Texture Analyser TA.XT plus), para realizar el
bioensayo de reconstitución del crecimiento ácido de un hipocótilo de pepino
inactivado térmicamente con el extracto de proteína de interés. Se ensayaron
dos cultivares de Fragaria ananassa (cvs. Sweet Charlie y Camarosa) en
frutos de distinta madurez fisiológica (blanco, 50% rojo y 100% rojo), observándose un aumento progresivo de la actividad Expansina
conforme al avance de la maduración del fruto.