DESARROLLO DE NANOPARTÍCULAS BIODEGRADABLES CON ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA PARA EL POTENCIAL TRATAMIENTO DE MICOSIS BUCALES

LAMAS, M. C.; LEONARDI, D.; TEJADA, G.

Buenos Aires

Congreso; SAP 2019; 2019

SAP

El miconazol (MN) es un agente antifúngico de amplio espectro perteneciente a la familia de los azoles utilizado ampliamente para el tratamiento de dermatofitosis, micosis cutáneas, pitiriasis, vaginitis fúngica y candidiasis bucofaríngea. La candidiasis es una infección fúngica causada por varias especies de Candida, entre las que se encuentran Candida albicans, Candida glabrata, Candida tropicalis, Candida parapsilosis y Candida krusei; entre ellas Candida albicans es el patógeno oportunista más importante. Las cepas de Candida residen como comensales en el tracto gastrointestinal, genitourinario y en la flora oral y conjuntival de todos los seres humanos. Estas levaduras son inofensivas para los individuos con un sistema inmunológico normal, pero al alterarse éste, los individuos corren el riesgo de desarrollar infecciones fúngicas. Las infecciones fúngicas tópicas suelen causar dolor, ardor y prurito, y por lo tanto, el uso de fármacos anestésicos como la lidocaína (LD), puede ser útil en las primeras etapas del tratamiento. En los últimos años se han desarrollado diversas formas de dosificación conteniendo MN para aplicaciones tópicas (bucales y vaginales), como ser films poliméricos, micropartículas, y nanopartículas lipídicas (Tejada, 2017 a).La nanoencapsulación empleando biopolímeros permite proteger al fármaco impidiendo su degradación al mismo tiempo que reduce la dosis del activo sin disminuir su actividad terapéutica. Además, estos sistemas podrían producir una liberación sostenida del activo, incrementando la actividad de las formulaciones en el tiempo y disminuyendo los efectos no deseados. Entre los polímeros inertes fisiológicos, biodegradables y no tóxicos, utilizados para la encapsulación de fármacos se encuentran el quitosano (CH) y la gelatina (GEL), ambos con propiedades mucoadhesivas (Tejada, 2017 b). El CH, posee carga positiva a pH < 6.5 , y tiene la capacidad de formar complejos de polielectrolitos cuando se combina con polímeros con carga negativa como la GEL, siendo muy adecuado para el desarrollo de diferentes tipos de sistemas de administración de fármacos funcionales. Por lo tanto, el objetivo del presente trabajo es obtener y caracterizar sistemas nanoparticulados basados en CH y GEL cargados con MN y LD para el tratamiento de la candidiasis bucal. Materiales y MétodosPreparación de nanopartículasLa GEL se disolvió en agua desionizada a 60 ºC, a esta solución se añadió gota a gota una solución etanólica de Pluronic F-127 (2% p/v), bajo agitación. Finalmente, se añadió a la solución el MN o la LD (ambos al 20% p/p respecto a los polímeros). Finalmente se disolvió CH en ácido acético (30% v/v) y se añadió gota a gota a la solución de gelatina (mantenida a 40 ºC) y se agitó a 400 rpm durante 24 h para reticular las partículas. Las dispersiones obtenidas se congelaron y se liofilizaron (Labconco, Kansas City, MO, EE. UU.) durante 24 h a -40 °C. La composición de las distintas formulaciones preparadas se presenta en la Tabla 1. Adicionalmente se sintetizaron nanopartículas sin fármacos que fueron empleadas como blancos de los sistemas.Tabla 1.- Composición de las nanopartículas desarrolladasSistemaCHGELMNLD[% p/v][% p/v][% p/p][% p/p]F1109020-F2257520-F3505020-F4752520-F5901020-F61090-20F72575-20F85050-20F97525-20F109010-20Determinación de la eficacia de encapsulaciónLa eficiencia de la encapsulación (EE) se determinó mediante diferentes métodos en función del fármaco cargado En el caso del MN se pesaron 10 mg de nanopartículas y se mantuvieron en agitación en 25 mL de acetonitrilo por 60 min, a fin de asegurar la total extracción del fármaco de los sistemas. La concentración de MN en la solución se determinó espectrofotométricamente midiendo la absorbancia a 232 nm por HPLC, empleando un cromatógrafo de la serie 1200 de Agilent Technologies (Santa Clara, EE. UU.). La determinación se llevó a cabo a 40 °C en una columna SiliaChrom C18 (150 × 4,6 mm, 5 μm) y usando como fase móvil una mezcla acetato de amonio (50 mM, pH 4): acetonitrilo (35:65) bombeado a un caudal de 1.5 ml min-1. Las concentraciones de MN se obtuvieron utilizando una curva de calibración, y este método se validó previamente. Por otra parte, la EE de la LD, se determinó mediante espectrofotometría UV a 265 nm (espectrofotómetro UV Shimadzu UV-1800 Kyoto, Japón). Tamaño, polidispersidad y potencial ZLos tamaños de los nanosistemas, en términos de diámetro hidrodinámico, se determinaron usando un equipo Malvern Zetasiser NanoSZ 90. Se prepraron dispersiones acusas de todos los sistemas y se realizaron las medidas por triplicado.El mismo equipo se utilizó para estimar la carga superficial en términos del potencial Z empleando las mismas dispersiones acuosas.Estudios de disoluciónLos estudios de disolución se realizaron en celdas de Franz de 7 mL de volumen conteniendo de agua destilada que contenía PEG 400 al 1% v/v a 37 °C. En diferentes intervalos de tiempo se tomaron muestras y el contenido de cada fármaco se determinó a 272 nm para el caso del MN y a 265 nm para la LD. Se añadió un volumen igual del medio de disolución después de cada recolección de muestras.Análisis termogravimétrico y calorimetría diferencial de barrido Se analizaron las propiedades térmicas de las partículas obtenidas mediante análisis termogravimétrico (TGA) y calorimetría diferencial de barrido (DSC). Los ensayos se realizaron en un calorímetro DSC TA Instruments Q800. Las muestras se calentaron en atmósfera de nitrógeno desde temperatura ambiente 300 °C a 10 ºC/min. Los ensayos de termogravimetría se realizaron en un equipo TGA-DTGA TA Instruments Q500, desde temperatura ambiente hasta 600° C a 10° C/min en atmósfera de aire.Actividad anti fúngica de las formulacionesLas formulaciones desarrolladas fueron evaluadas sobre un cultivo de C. albicans. Se determinó el halo de inhibición producido por los diferentes sistemas nanoparticulados a diferentes tiempos, y la concentración inhibitoria mínima de las formulaciones. Se realizaron 4 mediciones de los halos de inhibición.Resultados y Discusión En la Tabla 2 se presentan los valores de EE, tamaño, índice de polidispersidad (IPD) y potencial Z (PZ) de los diferentes sistemas.Tabla 2.- EE, tamaño, IPD y PZ de las nanopartículas desarrolladasFormulaEE [%]Tamaño [nm]IPDPZ [mV, pH 5.5]F165.14958.30.961-1.43F281.17149.80.81911.5F377.86***F495.25358.70.43413.95F566.76***F634.50***F757.13281.90.90211.3F897.29***F977.80***F1096.46****No reúne los criterios de calidad ya que son demasiado polidispersosDe acuerdo con los datos de la Tabla los sistemas resultaron, en general, polidispersos con lo cual, en muchos casos, no se obtuvieron datos fiables de tamaño (*). En la Figura 1 se muestra a, modo de ejemplo el histrograma obtenido para la formulación (F1) donde se aprecia la distribución de tamaños en función del número de partículas. Fig. 1 Distribución de tamaños en función del número de partículasLos datos de potencial Z son consistentes con los materiales de partida empleados. Es decir una mayor proporción de quitosano determina carga superficial positiva debido a la presencia de grupos amino protonados superficiales. Cuando gelatina es el componente mayoritario la carga, estimada mediante el Z pot., es negativa al mismo pH en la Tabla 2Análisis Termogravimétricos y Calorimetría diferencial de barridoA partir del análisis de las curvas de TGA y DSC se pudo concluir que la nanocapsulacion sería capaz de proteger a los fármacos de la degradación térmica.Estudios de disoluciónLas nanopartículas desarrolladas permitieron una rápida liberación de la LID (30% a los 30 minutos) y una liberación sostenida del MN (42 % luego de 6 horas de ensayo)Actividad anti fúngica de las formulacionesEn la Tabla 3 se presentan los valores promedios de los halos de inhibición producidos por los diferentes sistemas.Tabla 3.- Halo de inhibición producido (mm) a diferentes tiemposSistema2[h]4[h]6[h]8[h]24[h]F128,328,828,525,022,8F230,027,824,524,322,0F336,527,525,024,326,8F427,326,024,824,519,0F528,527,024,323,521,8MN30,326,825,020,514,5Los halos producidos por las diferentes formulaciones permitieron sostener la actividad del MN en el tiempo. Entre las nanopartículas desarrolladas, la formulación F3 mostró halos de 26.8 cm luego de 24h de ensayo, mientras que los halos producidos por el MN fueron de 14.5 cm. Este experimento demuestra que las nanopartículas fueron capaces de sostener la actividad del MN en el tiempo.Ejemplo de Referencias BibliográficasTejada (2017) a. ?Development and Evaluation of Buccal Films Based on Chitosan for the Potential Treatment of Oral Candidiasis?. AAPS PharmSciTech ASCE, Volume 18, Issue 4, 1 May 2017, Pages 936-946.Tejada (2017) b. ?Formulation and in-vitro efficacy of antifungal mucoadhesive polymeric matrices for the delivery of miconazole nitrate?. Materials Science and Engineering C, Volume 79, 1 October 2017, Pages 140-150.