MÉTODO DE CALIBRACIÓN PARA LAS MEDICIONES DE ESPECTROSCOPIA DE CORRELACIÓN DE FLUORESCENCIA

CASTELLANI, H.; RIQUELME, BIBIANA; DUMAS, D.; DE ISLA, N.; STOLTZ, J. F.

Rosario, Argentina

Congreso; VIII Congress - SSVI Annual meeting - SBR 2006; 2006

Se analiza la dinámica de biomoléculas en suspensión mediante la técnica de espectroscopia de correlación de fluorescencia (FCS). Esta técnica ha mostrado ser un método no invasivo que permite estudiar la difusión de moléculas libres y ligadas dentro de células vivas y en volúmenes del orden de los femtolitros. En este trabajo, se propone un método de calibración que permite determinar simultáneamente y en una única serie de mediciones, las dimensiones del volumen efectivo de excitación y el coeficiente de difusión de las biomoléculas en solución. Para ello se determinaron las funciones de autocorrelación G(t) a partir de las fluctuaciones en las intensidades de fluorescencia de suspensiones diluidas (concentraciones de 5 a 100 nM) de fragmentos Fab2 conjugados con Alexa Fluor 488 (peso molecular ~ 103 kD, Molecular Probes, A11017). Las mediciones de FCS fueron realizadas a 25 °C utilizando un sistema confocal FCS (Analytical Extension of Leica TCS SP2 AOBS Confocal System). Se realizó la modelización del fenómeno, aplicando adecuadas aproximaciones matemáticas y considerando que para una única especie en solución, el valor inicial de la función de autocorrelación, G(0), es inversamente proporcional al número de moléculas en el volumen de excitación. A partir del análisis de los datos mediante este algoritmo, se obtiene un volumen efectivo de (0.85 ± 0,03) fl de dimensiones wr = 0.48 µm y wz = 0.65 µm. Para los fragmentos Fab2 estudiados se obtiene un coeficiente de difusión D = (164 ± 6) µm2/s. Estos valores están en correspondencia con los obtenidos por otros investigadores con los métodos tradicionales de calibración, por lo cual podemos concluir que la metodología de calibración propuesta es adecuada. Los resultados obtenidos son de aplicabilidad inmediata, ya que los mismos serán utilizados en el estudio de células madres mesenquimáticas cultivadas a partir de médula ósea, mediante las mediciones de las propiedades de difusión y clustering del receptor TGFbeta II sobre dichas células.