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MEZCLAS CASEINATO DE SODIO/GOMA XANTANA: EVALUACIÓN FISICOQUÍMICA Y DEL PROCESO DE AGREGACIÓN ÁCIDA Hidalgo, María Eugenia1; Armendariz, Mirta1; Risso, Patricia1,2 1Fac. Cs. Bioquímicas y Farmacéuticas, UNR, Rosario; 2Óptica Aplicada a la Biología, IFIR (CONICET-UNR). E-mail: maruhidalgo80@yahoo.com.ar El caseinato de sodio (NaCAS) es un derivado de la fracción proteica más abundante de la leche bovina, las caseínas (CN). Es un ingrediente muy utilizado por la industria alimenticia debido a sus propiedades nutricionales y funcionales. Las partículas de NaCAS se encuentran en solución acuosa como moléculas proteicas individuales, oligómeros proteicos (nanopartículas de CAS) y hasta como submicelas de CN. Durante la acidificación del NaCAS, se forma una estructura de gel como resultado de la disociación y agregación de las fracciones caseínicas (aS1-, aS2-, b- y k-). La disminución del pH, generada por la adición de una lactona, la glucono-d-lactona (GDL), ha ganado la atención de la industria alimenticia debido a las ventajas que presenta respecto del uso de cultivos lácticos. Esta acidificación conduce a la pérdida de la estabilidad electroestática y consiguiente agregación de las partículas de NaCAS. La goma xantana (GX) es un polisacárido extracelular producido por la bacteria Xanthomonas campestris. Este polisacárido origina soluciones acuosas altamente viscosas y es ampliamente empleado en la industria de los alimentos como agente espesante, ya que permite controlar las características reológicas del producto final. En general, los alimentos contienen ambas clases de biopolímeros, proteínas y polisacáridos, en forma de complejas mezclas multicomponentes. La textura y la estabilidad final de los productos alimenticios dependen de las propiedades de ambos biopolímeros y de las interacciones que se establecen entre ellos. Tres sistemas diferentes pueden resultar de la mezcla de proteínas y polisacáridos en solución acuosa: a) separación de fases segregativa debido a una limitada compatibilidad termodinámica; b) separación de fases asociativa debido a la formación de un complejo por medio de interacciones débiles y no específicas; y c) soluciones homogéneas estables. Por lo tanto, resulta de interés evaluar el efecto de dichas interacciones sobre el proceso de agregación ácida de las mezclas proteína/polisacárido. Los objetivos de este trabajo fueron evaluar la compatibilidad termodinámica ocasionada por las interacciones entre el NaCAS y la GX, estudiar los posibles cambios estructurales del NaCAS en presencia del polisacárido y analizar el efecto de la cantidad de GDL adicionada (R), la temperatura (T) y la concentración de GX (CGX) sobre la cinética de agregación del NaCAS y sobre la estructura de los agregados formados. Para el estudio de la compatibilidad termodinámica NaCAS/GX se realizaron mezclas de ambos biopolímeros en distintas proporciones en buffer Tris-HCl 10mM pH 6,80 a T ambiente, y las mismas se incubaron 24 o 48hs a 25 o 35ºC, en condiciones de T y humedad controladas. Luego de este período, se verificó la existencia o no de separación de fases y/o aparición de turbidez mediante una inspección visual. Se observó que la mezcla mostró incompatibilidad termodinámica en todo el rango de concentración ensayado (CGX: 0 - 0,45%P/P; CNaCAS: 0 4%P/P). Se realizaron espectros de excitación y de emisión de la fluorescencia intrínseca (IF) proteica en ausencia y presencia de GX (Figura 1). Se observó que la IF disminuyó a medida que se incrementó la cantidad de polisacárido adicionado. Sin embargo, no se observaron cambios significativos en la longitud de onda de emisión (lem) máxima. Este comportamiento estaría vinculado a un cambio en el entorno de los fluoróforos intrínsecos proteicos hacia un medio más polar cuando la proteína se encuentra en presencia del polisacárido. Debido a que la agregación proteica está limitada por la difusión de las partículas, y que esta última depende de la viscosidad del medio (h), se evaluó el efecto de la GX sobre la misma. Para ello se prepararon soluciones acuosas de GX (0 - 0,30% P/P) a las que se les midió la h en un viscosímetro Brookfield, con geometría cono-plato, termostatizado a 35°C y a una velocidad de corte de 3rpm. Se observó que a medida que aumenta la concentración de polisacárido la viscosidad relativa (hr) creció exponencialmente (Figura 2). La agregación ácida de las mezclas NaCAS/GX se indujo por adición de GDL sólida a distintos R y a diferentes T, manteniendo constante la concentración de NaCAS (0,5%P/P). La cinética del proceso de agregación se estudió por turbidimetría, basándose en la dependencia de la turbidez con la longitud de onda en un rango donde no absorben los cromóforos proteicos (450-650nm), registrando simultáneamente los cambios de pH. El grado de compactación de los agregados formados al final del proceso, fue estimado a través de la dimensión fractal de los mismos. Para evaluar el efecto de los factores estudiados se aplicó un diseño de experimentos factorial completo 23, considerando como variables respuestas el tiempo al que comienza la agregación (tag), el pH a dicho tiempo (pHag) y la dimensión fractal (Df) de los agregados. Los parámetros estadísticos obtenidos del t-test ANOVA y los valores de p fueron utilizados para evaluar los factores e interacciones de orden 2 que resultaron significativos, asumiendo p < 0,05. Una vez determinados los mismos, se ajustaron las respuestas mediante el modelo correspondiente y se analizaron residuos comprobándose normalidad. Para visualizar el comportamiento de las variables respuestas se realizaron gráficos de superficies y contornos convenientes para cada situación. La Tabla I muestra los efectos y valores de p obtenidos para cada respuesta estudiada. Tabla I Factores Respuestas tag pHag Df Efecto Coef p Efecto Coef p Efecto Coef p Constante 42,42 0,002 5,02 <0,001 3,95 0,000 CGX (%P/P) No significativo No significativo -0,15750 -0,08 0,016 R -51,44 -25,89 0,023 No significativo No significativo T (°C) -44,94 -22,47 0,039 -0,6375 -0,32 0,010 0,13250 0,07 0,030 CGX*T No significativo No significativo 0,11750 0,06 0,044 r2 = 63,97% r2 = 64,09% r2 = 76,50% Sólo los términos lineales de R y T fueron estadísticamente significativos para tag, siendo la ecuación modelo: tag=42,42-25,89*R-22,47*T. El valor de pHag sólo dependió de T según pHag=5,02-0,32*T; y Df varió según Df=3,95-0,08*CGX+0,07*T+0,06 CGX*T. De acuerdo a estos resultados, tag aumenta al disminuir R o T, siendo ambos factores igualmente significativos. El aumento de R implica un incremento en la velocidad de descenso de pH y por tanto una disminución en el tiempo necesario para que se desestabilicen las partículas coloidales de NaCAS y comiencen a agregar. El incremento de T aumenta la velocidad de los procesos que conducen a la gelación y además se intensifican las interacciones de tipo hidrofóbico (endotérmicas) que participan en dicho proceso. Por otra parte, el incremento de T condujo a menores pHag, indicando que la fijación de los protones a los residuos protonables del NaCAS es exotérmica. El grado de compactación de los agregados formados, medidos a través de Df, aumentó con el incremento de T y disminuyó al crecer la CGX. Debido al aumento de T, por una parte se favorecerían las interacciones de tipo hidrofóbico durante la formación de dichos agregados. Por otro lado, al disminuir el tag disminuye la probabilidad de reestructuración que conduciría a un mayor grado de compactación. En este caso, el primer efecto es el que prevaleció. La GX, con carga negativa, al adicionarse a las soluciones de NaCAS conduce a un aumento de la estabilidad electrostática de las partículas proteicas antes y durante la agregación, conduciendo así a la formación de agregados menos compactos. En conclusión, estas ecuaciones modelo permitirían explicar y predecir el comportamiento de la cinética de agregación ácida y la microestructura de los agregados obtenidos. Figura 2. Variación de la viscosidad relativa (hr) de las soluciones de GX en todo el rango de concentraciones ensayado (0-0,30%P/P); Velocidad de corte: 3rpm; T 35ºC Figura 1. Espectros de emisión de fluorescencia intrínseca del NaCAS en ausencia (▬) y presencia de diferentes CGX: (▬) 8:1; (▬) 6:1; (▬) 4:1; (▬) 2:1; (▬) 1:1 y (▬) 1:1,5. CNaCAS 0,1% P/P; T 35ºC; Rango lem 300-400nm; longitud de onda de excitación (lexc) 286nm.