Evaluación de los cambios estructurales del caseinato de sodio en presencia de péptidos con actividad antioxidante y calcio

COGLIATI, SEBASTIÁN; HIDALGO, MARÍA EUGENIA; ALVAREZ, ESTELA

Rosario

Congreso; XVIII Congreso Argentino de Fisicoquímica y Química Inorgánica; 2013

Asociación Argentina de Investigación Fisicoquímica

Introducción: Las proteínas lácteas, en particular las caseínas, son fuente de péptidos bioactivos con potencial beneficio para la salud. La hidrólisis enzimática del caseinato de sodio (NaCAS), en condiciones suaves de pH y temperatura, puede generar componentes nutricionales bioactivos y funcionales. Estos péptidos (PA), de diferentes tamaños, con probada actividad antioxidante, tienen capacidad de unir y transportar Ca2+, al igual que los caseinatos, constituyendo una fuente de alta biodisponibilidad del ión, útil para suplementar alimentos.Las proteínas lácteas, en particular las caseínas, son fuente de péptidos bioactivos con potencial beneficio para la salud. La hidrólisis enzimática del caseinato de sodio (NaCAS), en condiciones suaves de pH y temperatura, puede generar componentes nutricionales bioactivos y funcionales. Estos péptidos (PA), de diferentes tamaños, con probada actividad antioxidante, tienen capacidad de unir y transportar Ca2+, al igual que los caseinatos, constituyendo una fuente de alta biodisponibilidad del ión, útil para suplementar alimentos. Objetivo: Estudiar cambios estructurales del NaCAS en diferentes relaciones NaCAS:PA, con y sin Ca2+. Materiales y Métodos: La proteasa P45 se obtuvo de un cultivo de Bacillus sp. P45. La hidrólisis de NaCAS (2%P/V) se realizó con relación enzima:substrato 1:50 e incubación a 45°C y pH 8. La reacción se inhibió a 1h o 3h calentando a 100ºC. Las muestras fueron centrifugadas 15min a 10.000 rpm a 4°C y el sobrenadante obtenido (PA1h y PA3h) se liofilizó. Se realizaron espectros de excitación y de emisión de la fluorescencia intrínseca (IF) proteica en ausencia y presencia de los cosolutos (PA1h, PA3h; Ca2+) empleando una lexc 286nm y lem 342nm. Se determinó la hidrofobicidad superficial (S0) de las diferentes muestras a concentraciones de Ca2+ ([Ca]) entre 0 y 1,2mM, rango de solubilidad donde la precipitación no es detectable, utilizando ANS como marcador fluorescente hidrofóbico1, empleando una lexc 396nm y lem 489nm.La proteasa P45 se obtuvo de un cultivo de Bacillus sp. P45. La hidrólisis de NaCAS (2%P/V) se realizó con relación enzima:substrato 1:50 e incubación a 45°C y pH 8. La reacción se inhibió a 1h o 3h calentando a 100ºC. Las muestras fueron centrifugadas 15min a 10.000 rpm a 4°C y el sobrenadante obtenido (PA1h y PA3h) se liofilizó. Se realizaron espectros de excitación y de emisión de la fluorescencia intrínseca (IF) proteica en ausencia y presencia de los cosolutos (PA1h, PA3h; Ca2+) empleando una lexc 286nm y lem 342nm. Se determinó la hidrofobicidad superficial (S0) de las diferentes muestras a concentraciones de Ca2+ ([Ca]) entre 0 y 1,2mM, rango de solubilidad donde la precipitación no es detectable, utilizando ANS como marcador fluorescente hidrofóbico1, empleando una lexc 396nm y lem 489nm. Resultados: Los valores de IF obtenidos para el NaCAS fueron mayores que los observados para los PA. Estos resultados coinciden con los S0 medidos, indicando un aumento de la hidrofilicidad proteica luego de la hidrólisis. La S0 de las mezclas NaCAS:PA (5:1; 2:1; 1:2; 4:1:1), resultó menor que la medida para el NaCAS (34±3), y mayor a la determinada para los PA (PA1h=14±3; PA3h=10±3), siendo los de más proporción de PA (1:2) los de S0 más alta (27±3). Ante el agregado de bajas [Ca] (0,4mM), la S0 de todas las muestras aumentó. Sin embargo, a valores más altos de [Ca] (1,2mM), la S0 del NaCAS disminuyó (25±2), y aumentaron la de los PA (PA1h=35±1; PA3h=25±1) y las mezclas (superiores a 70±4).Los valores de IF obtenidos para el NaCAS fueron mayores que los observados para los PA. Estos resultados coinciden con los S0 medidos, indicando un aumento de la hidrofilicidad proteica luego de la hidrólisis. La S0 de las mezclas NaCAS:PA (5:1; 2:1; 1:2; 4:1:1), resultó menor que la medida para el NaCAS (34±3), y mayor a la determinada para los PA (PA1h=14±3; PA3h=10±3), siendo los de más proporción de PA (1:2) los de S0 más alta (27±3). Ante el agregado de bajas [Ca] (0,4mM), la S0 de todas las muestras aumentó. Sin embargo, a valores más altos de [Ca] (1,2mM), la S0 del NaCAS disminuyó (25±2), y aumentaron la de los PA (PA1h=35±1; PA3h=25±1) y las mezclas (superiores a 70±4). Conclusiones: Los resultados obtenidos de IF y S0 de las mezclas NaCAS:PA demostraron que la autoasociación de los agregados coloidales (AC) depende de la composición de las mismas. El agregado de Ca2+ produce dos efectos, a bajas concentraciones, el aumento de la S0 se debería a la disociación de los AC que expondría más grupos hidrofóbicos al medio. A concentraciones más altas del ión, el NaCAS forma AC más compactos que exponen menos grupos hidrofóbicos al  medio, a diferencia de las mezclas donde la S0 aumenta significativamente2. Por lo tanto, la conformación o estructura adoptada por el NaCAS dependerá de la presencia de los PA como de la concentración de Ca2+ empleada.Los resultados obtenidos de IF y S0 de las mezclas NaCAS:PA demostraron que la autoasociación de los agregados coloidales (AC) depende de la composición de las mismas. El agregado de Ca2+ produce dos efectos, a bajas concentraciones, el aumento de la S0 se debería a la disociación de los AC que expondría más grupos hidrofóbicos al medio. A concentraciones más altas del ión, el NaCAS forma AC más compactos que exponen menos grupos hidrofóbicos al  medio, a diferencia de las mezclas donde la S0 aumenta significativamente2. Por lo tanto, la conformación o estructura adoptada por el NaCAS dependerá de la presencia de los PA como de la concentración de Ca2+ empleada. Referencias Bibliográficas: 1 Kato, A. and S. Nakai (1980) Hydrophobicity determined by a fluorescence probe method and its correlation with surface properties of proteins. Biochim. Biophys. Acta 624, (1), 13-20.Kato, A. and S. Nakai (1980) Hydrophobicity determined by a fluorescence probe method and its correlation with surface properties of proteins. Biochim. Biophys. Acta 624, (1), 13-20. 2 Alvarez, E., P.H. Risso, M.A.M. Canales, M.S. Pires, and C.A. Gatti (2008)Hydrodynamic properties-structure relationship for sodium caseinates in presence of calcium. Colloid Surface A 327, (1-3), 51-56.Alvarez, E., P.H. Risso, M.A.M. Canales, M.S. Pires, and C.A. Gatti (2008)Hydrodynamic properties-structure relationship for sodium caseinates in presence of calcium. Colloid Surface A 327, (1-3), 51-56.