Expresión de Angiostatina humana recombinante en Escherichia coli

NIOSI LUCIANO; SGUAZZA GUILLERMO H; PECORARO MARCELO; MIGNONE CARLOS

Ciudad de Buenos Aires

Jornada; X Jornadas de Farmacia Y Bioquimica Industrial; 2009

Expresión de Angiostatina humana recombinante en Escherichia coli. Luciano Niosi 1 2; Guillermo H Sguazza 2; Marcelo R Pecoraro 2; Carlos F Mignone 1. 1 Centro de Investigación y Desarrollo en Fermentaciones Industriales  (CINDEFI), CONICET-UNLP, lniosi@biotec.org.ar. 2 Cátedra de Virología, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Nacional de  La Plata. Tel 4236663/4. Int: 419 Introducción La angiogénesis, es un proceso por el cual se desarrollan nuevos vasos sanguíneos a partir de otros preexistentes. En las células normales se encuentra altamente regulado dado que desempeña un papel fundamental en el desarrollo, la morfogénesis, la reparación de las heridas, y la reproducción. Sin embargo, la vascularización incontrolada y la persistencia de la angiogénesis están involucradas en muchos procesos patológicos como el cáncer. La angiostatina es un fragmento interno del plasminogeno con una masa molecular relativa de 38 kDa que actúa como inhibidor de la angiogénesis. In vivo es capaz de inhibir específicamente la proliferación endotelial y el crecimiento de tumores primarios evitando que se formen nuevos vasos sanguíneos que suministren oxígeno y nutrientes. In vitro, la angiostatina inhibe la proliferación del endotelio celular y la migración, por tanto induce una regresión en el ciclo celular derivando en la apoptosis de la célula. La obtención de angiostatina a partir de plasminógeno ha demostrado ser dificultosa con lo cual la producción de angiostatina purificada a partir de sistemas de expresión recombinante ofrece una alternativa para su obtención y resulta de enorme valor para el desarrollo de terapias antitumorales. El objetivo del presente trabajo fue clonar el gen que codifica la angiostatina humana en un vector procariotico bajo el control del promotor de la fosfatasa alcalina (phoA) de Escherichia coli y  optimizar las condiciones de crecimiento, de esta manera el sistema es inducido debido a la disminución en la concentración de fosfato inorgánico en el medio de cultivo. Materiales y Métodos El segmento que codifica la angiostatina humana conocido como Kringle I-IV (correspondiente a los residuos 98 al 458 del plasminogeno humano) fue amplificado mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) por medio de los primers 5´ CGCCATATGGTGTATCTCTCAGAGTGC 3´ y  5´ACACCGTCGACTTACTACGCTTCTGTTC 3´. El producto amplificado fue clonado en el vector de clonado rápido pCRTOPO2.1 (Invitrogen) y posteriormente subclonado en el vector de expresión pBACE bajo el control del promotor de la fosfatasa alcalina, con la construcción así obtenida se transformaron bacterias competentes de Escherichia coli BL21(DE3). Las bacterias recombinantes se cultivaron en modo batch en erlenmeyers agitados de 1 L de capacidad conteniendo 100 ml de medio de cultivo sintético conteniendo MOPS como  sistema buffer según Neidhardt et al. (1974). Todos los cultivos se llevaron a cabo por duplicado, con 100 µg/ml de ampicilina y diferentes concentraciones de fosfato inorgánico inicial en forma de K2HPO4 (0,2; 0,4; 0,8 y 1,6 mM) para estimar el tiempo de inducción del sistema. En todos los casos se utilizó una concentración de 5 g/L de glucosa como única fuente de carbono y energía. Como inoculo se sembraron 2 ml por cada 100 ml de cultivo de una suspensión de bacterias en agua estéril provenientes de un agar LBAMP 100 µg/ ml con 48 hs de incubación a 37 C. La DO625 inicial fue siempre de 0,14. Se incubo con agitación a 180 rpm a 37 C. Se tomaron muestras en forma periódica para la determinación peso seco, glucosa remanente, fosfato y amonio. Para la determinación de la presencia de angiostatina en las muestras tomadas se realizaron ensayos por electroforesis en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE) 12,5% en condiciones no reductoras y Western Blot (WB) utilizando un anticuerpo monoclonal anti-angiostatina (Santa Cruz Cat. 73708). Resultados En la figura 2 se observa que a medida que disminuye la concentración inicial de fosfato la velocidad específica de crecimiento (m) disminuye y comienza a depender marcadamente de la concentración de fosfato a una concentración por debajo de 1 mM. En la figura 1 se aprecia un comportamiento diferencial en el crecimiento a partir de las 7,6 hs aproximadamente momento en el cual se evidencia un consumo total de fosfato para las muestras conteniendo 0,8; 0,4 y 0,2 mM de fosfato inicial. No se observa fase lag o de retardo. En todas las condiciones estudiadas se obtuvo un muy bajo rendimiento celular arrojando un valor promedio de 0,26 g/g, lo cual podría ser indicativo de la formación de algún producto derivado del metabolismo. Normalmente E. coli produce AcH, sin embargo no se detectó este compuesto en las muestras analizadas por HPLC lo que podría resultar ventajoso debido al conocido efecto adverso que tiene el AcH sobre la expresión de proteínas recombinantes. (Fig. 2) (Fig. 1) Tiempo (hs) 0 2 4 6 8 10 12 Peso Seco (g/l) 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 0,2 mM [PO -3 1,6 mM [PO 4 ] -3 0,8 mM [PO 4 ] -3 0,4 mM [PO 4 ] -3