Estudio Búsqueda e identificación de microorganismos antárticos con capacidad queratinolítica.

IVANA CAVELLO, SABRINA FESTA, BRENDA BEZUS, BIBIANA COPPOTELLI, IRMA MORELLI, GABRIELA GARMENDIA, SILVANA VERO, SEBASTIÁN CAVALITTO.

Ciudad de Buenos Aires

Simposio; Simposio Argentino de Bioprocesos 2016 (SAPROBIO).; 2016

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1. Introducción La queratina, proteína estructural, fibrosa e insoluble es el principal componente de la piel y sus apéndices (pelos, plumas, uñas, cuernos, pezuñas y lana) cuya característica principal es su gran estabilidad y resistencia a la degradación por parte de proteasas comunes debido a su empaquetamiento compacto y a la presencia de puentes disulfuro en su molécula. Las plumas son uno de los principales residuos de naturaleza queratínica producidos por actividades agroindustriales y presentan un serio problema ambiental debido a su escasa utilidad como materia prima y a la consecuente necesidad de disposición. Las queratinasas (E.C.3.4.99.xx) son una clase particular de proteasas que presentan la capacidad de degradar la queratina, presentan una gran especificidad de sustratos y son activas frente a sustratos proteicos solubles e insolubles. En virtud a esta amplia especificidad, robustez y diversas propiedades bioquímicas, son actualmente consideradas como los nuevos biocatalizadores con potenciales aplicaciones en varias industrias: además de poder reemplazar a las proteasas convencionales en las aplicaciones industriales, son de inmensa utilidad en sectores como el del reciclaje de residuos, especialmente las plumas, en el sector de curtido de pieles, en la industria textil, para el desarrollo de fertilizantes y en la cosmética. El desarrollo de nuevos procesos biotecnológicos requiere la búsqueda permanente de nuevos microorganismos y nuevas enzimas. Es por dicho motivo que el estudio de los ambientes extremos y su biodiversidad microbiana ha recibido un gran impulso en los últimos años. Las investigaciones sobre los microorganismos extremófilos han adquirido gran relevancia debido a sus potenciales aplicaciones biotecnológicas y a las ventajas del desarrollo de bioprocesos a bajas temperaturas. Sin embargo, solo una pequeña fracción de la diversidad microbiana ?en cuanto a la producción de enzimas extremófilas- en ambientes extremos ha sido estudiada hasta el momento.El siguiente trabajo presenta la búsqueda de microorganismos antárticos queratinolíticos, su caracterización e identificación.2. Metodología 1.Búsqueda y caracterización de cepas productoras de queratinasas.Se trabajó con muestras provenientes de la Península Fildes (Expedición Antarkos XXXII-2016) para la búsqueda de microorganismos queratinolíticos. Para su aislamiento se procedió de la siguiente manera: 1 g de cada muestra se puso en contacto con 10 ml de solución salina y se incubaron a 20°C durante 15 minutos 150 rpm. A continuación 0.5 ml del sobrenadante fueron transferidos a 50 ml de un medio mineral mínimo suplementado con 10 g/l de plumas como fuente de carbono, nitrógeno y energía (20ºC, 150 rpm). Luego de 72 h, aquellos cultivos donde se observó degradación parcial o total de las plumas fueron sembrados (diluciones seriadas) sobre agar nutritivo con el fin de observar la diversidad microbiana cultivable y seleccionar todas las colonias que presentaran diferencias morfológicas entre sí. Dichas colonias fueron purificadas mediante repiques sucesivos en agar nutritivo.Las colonias aisladas fueron sometidas a un screening de actividad proteolítica utilizando agar leche. Aquellas colonias que luego de 48 h de incubación mostraron un halo de degradación distintivo fueron consideradas productoras de proteasas y se eligieron para un último paso de selección. Dado que el screening utilizando agar leche ofrece una aproximación preliminar- al permitir separar entre las cepas productoras y no productoras de proteasas- aquellas que mostraron actividad proteolítica fueron sometidas de manera individual a un nuevo cultivo líquido con plumas como única fuente de carbono y nitrogeno. Para ello, 0.5 ml de un pre-inóculo se sembraron en 20 ml de medio mineral mínimo suplementado con 10 g/l de plumas (20ºC, 150 rpm). Los cultivos se observaron diariamente en búsqueda de aquellos microorganismos capaces de degradar efectivamente de las plumas.2.Caracterización fenotípica y genotípica de las cepas seleccionadas.La caracterización fenotípica de las bacterias seleccionadas se llevó a cabo realizando diferentes pruebas bioquímicas entre las que se incluyó: tinción de gram, producción de catalasas y oxidasas, movilidad, producción de esporos, hidrólisis de almidón, fermentación de hidratos de carbono, y otras, siguiendo los protocolos descriptos en el Manual Bergey (9º edición). Sumada a la caracterización fenotípica, algunos de los microorganismos seleccionados fueron además identificados filogenéticamente mediante la amplificación por PCR y secuenciación del gen 16S ARNr utilizando un set de primers universales 27F y 1387R.3.Resultados y DiscusiónDurante la expedición Antarkos XXXII se recolectaron una serie de muestras sólidas (guano de pingüino, plumas, musgos, líquenes, etc) para la búsqueda de microorganismos de interés biotecnológico. En este trabajo se enfocó la búsqueda en microorganismos capaces de degradar plumas mediante la producción de enzimas queratinolíticas. Se testearon 11 muestras diferentes, de las cuales, a los 3 días de incubación, se observó degradación completa de las plumas en 3 de las muestras, en tanto que 5 muestras más lo hicieron a los 7 días y en las restantes no se observó degradación. Mediante el cultivo en medio sólido de las muestras se lograron obtener un total de 23 colonias de diferente morfología. El screening en agar leche para la selección de microorganismos con actividad proteolítica demostró que, de los 23 microorganismos aislados, sólo 11 de ellos desarrollaron halo de degradación alrededor de la colonia. Estos microorganismos fueron seleccionados para el estudio de la producción de queratinasas en medio líquido. De los 11 microorganismos proteolíticos sólo 7 fueron capaces de degradar las plumas a 20°C al cabo de 3-7 días de cultivo. Mediante la identificación molecular basada en la secuenciación del gen 16SARNr se encontró que 4 de las bacterias se relacionaron con el género Pseudomonas, 2 con el género Flavobacterium y la restante con género Janthinobacterium. El territorio antártico ha comenzado a ser foco para la búsqueda de nuevos microorganismos capaces de producir enzimas activas a bajas temperaturas por la reducción en los costos que esto significa. Hasta el momento, microorganismos pertenecientes al género Lysobacter, Arthrobacter, Chryseobacterium, Microbispora y Streptomyces han sido reportados como queratinolíticos (Verma et al., 2016).5.Conclusiones La producción de queratinasas por estas bacterias adaptadas al frío resulta biotecnológicamente atractiva y podría ser valiosa para la reducción de los costos de energía en la aplicación de este tipo de enzimas en diferentes procesos industriales como alternativa a sus contrapartes mesófilas y termófilas.