PRODUCCIÓN DE BIOETANOL A PARTIR DE MELAZA DE SOJA

CRESPO JUAN MANUEL; SEBASTIAN CAVALITTO

Santa Fé

Simposio; SAPROBiO Simposio Argentino de Procesos Biotecnológicos; 2014

Introducción: El complejo sojero argentino es uno de los sectores más dinámicos de la economía del país, generando cerca del 30% de divisas que ingresa de las exportaciones y que representa el 30% del PBI del sector agro industrial. Argentina es el líder exportador de aceite de soja, harina de soja, biodiesel de soja y el tercero en cuanto a porotos, como consecuencia de las tasas aplicadas sobre las exportaciones de soja que favorecen la exportación de productos derivados de esta, lo cual mejoró la matriz productiva. Esto se ve reflejado en la importante capacidad instalada que posee el país para la obtención de aceite y sus derivados (Joseph and Mergen 2011). La melaza de soja es un subproducto generado en la producción de extractos de proteína de soja. A modo de ejemplo una industria que produce 600 Ton/día de concentrado proteico puede generar hasta 200 Ton/día de melaza (Siqueira et al, 2008), lo que implica muy grandes cantidades de este desecho susceptibles de ser transformadas en algún producto de utilidad, incrementando la renta obtenida por tonelada de soja ingresada. Muchas melazas o jugos de diferentes fuentes vegetales (azúcar de caña, de remolacha, almidón de maíz, bagazo, etc.) son utilizadas como materia prima para la producción de bio-etanol como fuente de energía. Dado que la melaza de soja posee azúcares no fermentables como la estaquiosa y rafinosa, es necesario hidrolizar los enlaces 1-6 galactósidos presentes, lo que permite la liberación de galactosa y sacarosa. Estas fuentes de carbono resultan fácilmente asimilables por levaduras para su posterior bioconversión en etanol. Metodologías 1.Seleción de levaduras productoras de etanol: Se analizaron diferentes cepas no comerciales de Saccharomyces cereviseae provenientes de cultivos vínicos y se procedió a la selección de la mejor cepa a través del análisis de los parámetros fisiológicos de crecimiento bajo condiciones de cultivo batch. Se seleccionó aquella que produjo una mayor cantidad de etanol (mayor rendimiento) a partir de sacarosa como fuente de carbono 2. Analisis de la melaza de soja: A la misma se le determinó el contenido de azucares reductores (por Somogyi-Nelson), azucares totales (por fenol sulfúrico) y el contenido especifico de azucares por HPLC usando glucosa, galactosa, sacarosa, rafinosa y estaquiosa como patrones. 3. Hidrólisis de los azucares de la melaza: Dado que la rafinosa y la estaquiosa poseen enlaces alfa galactósidos que no son hidrolizables por las levaduras, se estudió la hidrólisis de dichos azucares contenidos en la melaza para incrementar el contenido de azucares fermentables y, por consiguiente, de etanol producido. 3.1. Hidrólisis Química: Se utilizó ácido clorhídrico y sulfúrico a fin de hidrolizar los enlaces galactosa-galactosa y glucosa-galactosa presentes en la estaquiosa (azúcar mayoritario en la melaza) a fin de obtener azucares fermentables por las levaduras. Se utilizaron concentraciones de ácido entre 0.01N final hasta 1N final a temperaturas de 80°C y 100°C. 3.2 Hidrólisis Enzimática: Se estudió la capacidad de hidrólisis de la enzima -galactosidasa. Para ello se incubaron distintas soluciones de la enzima (con concentraciones variables) con rafinosa (como azúcar modelo) y con la melaza de soja. Se analizaron diferentes concentraciones de enzima, diferentes tiempos de incubación, diferentes pH y varias temperaturas. 3. Fermentación: Se procedió a la realización de cultivos batch en condiciones anaeróbicas, de la levadura S. cereviseae GL15, previamente seleccionada por su eficiencia en producción de alcohol. Se llevaron a cabo cultivos cuya fuente de carbono y energía son los azúcares presentes en la melaza de soja (azúcares totales equivalente a aprox 145 g.l-1). 4. Analítica de los cultivos: A intervalos regulares, muestras del cultivo fueron analizadas en función de pH y DO. Una porción de las mismas se centrifugaron por 10 min a 5000 xg y el sobrenadante se mantuvo a -20 para su posterior análisis. 4.1. Determinación de Etanol: Kit de Boehringer Mannheim, la concentración se obtiene en g/l, para lo cual se debe considerar la densidad del etanol, 0.79 g/ml, para reportar en porcentaje volumen (%V), es decir ml etanol/ 100 ml muestra. 4.2. Azúcares totales: Método colorimétrico del fenol-sulfúrico, utilizando sacarosa como patrón 4.3. Azúcares reductores: Se determinaron por el método de Somogyi-Nelson usando glucosa como patrón 4.4 Azúcares Individuales: HPLC Columna: SHODEX SC-1011 COL; Termostatizador: Column Heater Module (Walters); Detector: Refractive index Detector 2414; Autosampler: Auto injector SIL-9A; Adquisidor de datos: Empower; Condiciones: H2O 0.6ml.min-1 a 80°C; Volumen de Inyección: 20ml. Resultados y conclusiones Se analizó la capacidad de producir etanol de 12 cepas de Saccharomyces cereviseae utilizando un medio de cultivo completo con sacarosa como fuente de carbono. Se determinó que la cepa GL15, aislada por nuestro grupo sobre frutas de la zona de Berisso, Provincia de Buenos Aires, produjo una concentración de alcohol equivalente al 11% v/v. Esta cepa es la que se utilizaría luego para fermentar la melaza de soja. Dicha melaza contiene una gran cantidad de azúcares no fermentables que son necesarios hidrolizar. Dos metodologías fueron analizadas, primero la hidrólisis ácida con ácido sulfúrico ó con ácido clorhídrico y la hidrólisis enzimática. En la primera, concentraciones crecientes de ambos ácidos a diferentes temperaturas (100°C y 80°C) fueron analizadas. No se observó mediante determinación de azúcares por HPLC que la eficiencia de la hidrólisis fuera alta, asimismo se observó la formación de coágulos que dificultaría el proceso desde el punto de vista operativo/industrial, la utilización de altas concentraciones de ácido a altas temperaturas y la obtención de un trisacárido que no puede ser metabolizado como consecuencia de la hidrólisis de sólo un enlace del tetrasacárido estaquiosa muestran que el proceso de hidrólisis ácida no es eficiente para el proceso que se plantea en este trabajo. La enzima -galactosidasa hidroliza los enlaces 1-6 galactósidos de diferentes oligosacáridos. Se analizaron decenas de variantes entre tiempo, temperatura y pH óptimo de hidrólisis, resultando las 4hs de incubación a 55°C y pH5 una de las mejores opciones, permitiendo triplicar la concentración de azúcares reductores presentes en la melaza. Se llevaron a cabo cultivos en anaerobiosis a concentraciones de azúcar baja (melaza diluida 30g.l-1 de azúcares totales) a fin de analizar el comportamiento que la levadura tenía en este tipo de medio de cultivo dónde fue posible estimar de manera global entonces que el rendimiento de alcohol fue de 0.52 gEtOH/gS y el de biomasa de 0.11 gX/ gS. Como los rendimientos resultaron satisfactorios se procedió al crecimiento en anaerobiosis de la levadura en medio conteniendo la melaza concentrada (aprox. 145g.l-1 de azúcares totales) y extracto de levadura. Habiendo partido de 111g.l-1 de azucares fermentables, el rendimiento de etanol obtenido fue de 0.47 gEtOH/gS, rendimiento muy cercano al máximo teórico para etanol. Conclusión, La hidrólisis enzimática seguida de una fermentación anaeróbica resulta ser una buena estrategia para producir etanol a partir del residuo estudiado.