Exopoligalacturonasa ácida inducible de Aspergillus kawachii: purificación y caracterización parcial

BYRNE, CHRISTIAN E.; ROJAS, NATALIA L.; VOGET, CLAUDIO E.; CAVALITTO, SEBASTIÁN F.

La Plata

Simposio; Segundo Simposio Argentino de Procesos Biotecnologicos (II SAProBio); 2012

El hongo filamentoso Aspergillus kawachii IFO 4308 se caracteriza por producir pectinasas con la interesante propiedad de ser activas y estables a pH más ácidos que sus equivalentes producidas por otros microorganismos. De ellas las más ampliamente estudiadas han sido las poligalacturonasas (PGasas), que son glicosidasas que hidrolizan las uniones α-D-(1→4) entre residuos de ácido galacturónico (AGA) en las pectinas. En estudios previos se ha demostrado que este hongo produce al menos dos PGasas activas a pH 2,2 cuando se cultiva en un medio líquido a base de sales, triptona y diferentes fuentes de carbono. Una de estas enzimas, PG1, es la PGasa ácida dominante en aquellos cultivos que emplean glucosa como fuente de carbono y energía. Sin embargo, cuando la fuente de carbono es pomaza de limón (rica en pectinas) se induce la síntesis de otra PGasa ácida, a la que se denominó PG1’. El presente trabajo tiene el objetivo de concentrar, purificar y determinar distintas características bioquímicas de PG1’ a fin de compararlas con las de la PG1. Metodología A. kawachii fue cultivado en un medio mineral líquido usando pomaza de limón como fuente de carbono. El cultivo se realizó en erlenmeyer agitado a 30°C y 200 rpm durante 30 hs en oscuridad. Una vez finalizado, el cultivo se filtró través de tela muselina y filtros de nitrato de celulosa, se concentró por evaporación a presión reducida y se sometió a una serie de separaciones cromatográficas de intercambio iónico y exclusión molecular con un equipo ÄKTA-FPLC. La actividad PGasa se determinó empleando ácido poligalacturónico (APG) como sustrato y midiendo el incremento de grupos reductores por el método de Somogyi-Nelson. Los distintos pasos del proceso de purificación fueron analizados mediante SDS-PAGE. También se realizó un isoelectroenfoque y un zimograma con un gel de agarosa para detectar las bandas activas a pH 2,2. Asimismo, los geles se sometieron a una tinción de ácido periódico-Schiff (PAS) para determinar el eventual carácter glicoproteico de la enzima. Finalmente, la enzima purificada se utilizó para la determinación del pH óptimo para la hidrólisis de APG, los parámetros cinéticos sobre APG y el análisis de los productos de hidrólisis de APG mediante cromatografía en capa fina. Resultados y conclusiones El filtrado de un cultivo de A. kawachii con pomaza de limón como fuente de carbono posee actividad PGasa a pH 2,2. Las separaciones cromatográficas permitieron purificar la enzima inducible PG1´ hasta la homogeneidad, a juzgar por el SDS-PAGE. El peso molecular estimado por este método fue de 70 kDa. En el isoelectroenfoque se observa una banda amplia y difusa centrada a un punto isoeléctrico de aproximadamente 4,5. El zimograma permitió verificar la presencia de diversas isoenzimas. La tinción de PAS permitió demostrar que esta enzima se trata de una glicoproteína. El pH óptimo para APG fue de 3,5, manteniéndose un 50% de la actividad a pH 2,2 y más de un 30 % a pH 5,0. Los parámetros cinéticos de PG1’ sobre APG fueron determinados en buffer citrato fosfato pH 4,0 a 37°C. Utilizando una regresión lineal de Lineweaver – Burk se obtuvo un valor de Km de 2,3 mg/ml y una Vmáx de 174 U/mg. El único producto soluble liberado en la hidrólisis de APG por PG1’ fue el ácido galacturónico, lo que indica que esta enzima es una típica exopoligalacturonasa fúngica. Con la enzima PG1 se observó también la aparición de oligómeros, lo que es consistente con un mecanismo endo. Se comprobó también que PG1’ es capaz de degradar ácido digalacturónico, ácido trigalacturónico y otros oligómeros a AGA. Comparando las propiedades bioquímicas de la enzima inducible PG1´ con aquellas publicadas para la enzima constitutiva PG1 podemos detectar dos diferencias sustanciales. Una de ellas es que PG1´ presenta un punto isoeléctrico aproximadamente una unidad de pH superior, lo que justifica una buena separación de ambas mediante cromatografía de intercambio iónico. Por otro lado, PG1 es prácticamente inactiva a pH 5,0, mientas que PG1´ conserva más del 30% de la actividad óptima a ese pH y es aún activa a pH 6,0. Estos hallazgos sugieren una revisión de la clasificación de las PGasas de A. kawachii en ácidas y no ácidas de acuerdo a su actividad relativa a pH~2 y 5,0, tal como se postulara en trabajos anteriores.