Caracterización de la interacción entre receptores muscarínicos M4 y arrestina-2. Modulación por GRK2

BAYONÉS L; BELTRAME SP; WALDNER CI; GOIN JC

Corrientes

Congreso; XLVI Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Farmacología Experimental; 2014

Sociedad Argentina de Farmacología Experimental

Trabajos previos sugieren que los receptores muscarínicos de acetilcolina (RM) activados por agonista son fosforilados por  kinasas GRK e interaccionan con arrestinas (Arr). Esta interacción promueve desensibilización y eventualmente internalización del receptor, pudiendo activar rutas de señalización independientes de proteínas G. En este trabajo caracterizamos la interacción entre RM4 y Arr-2 inducida por agonista mediante "transferencia de energía bioluminiscente en resonancia" (BRET) y evaluamos la participación de GRK2 en dicha interacción. Células HEK293 expresando las proteínas de fusión RM4-RLuc y Arr-2-YFP fueron tratadas con carbacol y la señal BRET -indicativa de interacción proteína-proteína- fue monitoreada mediante luminometría. El agonista estimuló el reclutamiento de Arr-2 a RM4 en forma dependiente del tiempo y la concentración,  y estos efectos no fueron modificados por la sobreexpresión de GRK2 [+ vs - GRK2: k (min-1): 0,117 ± 0,015 vs 0,094 ± 0,010; Emax (mB): 17,8 ± 0,3 vs 17,6 ± 0,3; EC50 (µM): 2.0 ± 0,4 vs 1.6 ± 0,4]. El agonista parcial pilocarpina estimuló la interacción RM4/Arr-2 con menor Emax respecto al agonista total (10,2± 0,6 mB) (p<0.05), mientras que el antagonista atropina inhibió el efecto de carbacol en forma dependiente de la concentración (IC50: 1,8 ± 0,1 µM). La sobreexpresión de GRK2 o su dominante negativa K220A, en cantidades crecientes, no modificó la interacción RM4/Arr-2 promovida por carbacol. Concluimos que Arr-2 es reclutada al RM4 activado y que esta interacción es independiente de GRK2 en células HEK293.