Disrupción del metabolismo de ADP-ribósidos en T. cruzi por CRISPR/Cas9: Alteración en la respuesta al daño genómico y progresión del ciclo celular

KEVORKIAN ML; VILCHEZ LARREA SC; FERNÁNDEZ VILLAMIL SH

Resistencia

Congreso; XXX Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Protozoología; 2018

SAP

La ADP-ribosilación es una modificación postraduccional de proteínas, partícipe en la reparación del dañoen ADN, regulaci´on transcripcional y transmisión de señales. En T. cruzi, este metabolismo es orquestadopor la poli(ADP-ribosa)polimerasa (TcPARP) y la poli(ADP-ribosa)glicohidrolasa (TcPARG). Resultadosprevios mostraron que TcPARP se activa frente a agentes genotóxicos y que inhibidores de PARP-1 o PARGalteran la formación de ADPr y la tasa de crecimiento de epimastigotes. El uso de inhibidores para el estudio de la función de ADPr en T. cruzi ha sido útil, pero es posible que la inhibición parcial de estasenzimas enmascare otros efectos o que algunos roles se den por interacción directa con otras proteónas. Laadaptación del sistema CRISPR-Cas9 para tripanosomótidos permitió la obtención de líneas de CL Brenertransfectadas con sgRNA dirigido contra TcPARP (Cas9PARP) o TcPARG (Cas9PARG). En condicionesbasales, 36 % de la población del cultivo Cas9PARG mostró acumulación ADPr nuclear, a diferencia de loobservado en la cepa silvestre (5,9 %) y Cas9Scramble (ARN guía sin blanco genómico) (6,6 %). Tambiénse observó acumulación del daño del ADN en la línea Cas9PARP, indicando que la ausencia de TcPARPimpide la correcta reparación de rupturas del ADN, incluso aquellas ocasionadas por el metabolismo basal.El tratamiento con H2O2 (300 uM ? 10 min) provocó un aumento de ADPr en todas las líneas, excepto en20 % de la población Cas9PARP, que demostró ser incapaz de generar estos polímeros. La acumulación deADPr disminuyó a los 30 min post-tratamiento, menos en Cas9PARG, en la cual se mantuvo el polímero nuclear en más del 99 % de la población. Cas9PARP y Cas9PARG mostraron una disminución de 26 % y60 % de la tasa de crecimiento con respecto a la cepa silvestre, apoyando los resultados previos. El análisisde la progresión del ciclo celular mediante citometría de flujo indicó que Cas9PARG presenta un retraso enla entrada en fase S, así como un aumento, en condiciones basales, de la población necrótica (17,4 %). Estefenómeno también se observó en menor nivel (8 %) en la línea Cas9PARP. Ensayos preliminares indican quelas líneas Cas9PARP y Cas9PARG presentarían una mayor tasa de metaciclógenesis en medio TAU3AAG,pero también se observó una menor capacidad autofágica que la línea silvestre durante el hambreado enPBS. Estos resultados señalan que el metabolismo de ADPr en estos par´asitos podría estar cumpliendomúltiples y diversas funciones.