Análisis de la autofosforilación de una CDPK de Solanum tuberosum

GRANDELLIS CAROLINA; VASTI CECILIA; BIALER MAGALÍ; ULLOA RITA M

Buenos Aires

Congreso; RedBio 2011; 2011

RedBio

La fosforilación de proteínas es la modificación post-traduccional más difundida en células. Las proteínas quinasas dependientes de calcio (CDPKs) son transductoras de las variaciones intracelulares del catión y participan en procesos de desarrollo como la tuberización en planta de papa, la formación del nódulo simbiótico en Medicago sp y el desarrollo de la raíz en Medicago truncatula, y cumplen diversas funciones fisiológicas, tales como la tolerancia al frio, salinidad y sequía en arroz, respuestas defensivas en tabaco y respuesta a ABA en Arabidopsis. Además de regularse por calcio, y en algunos casos por proteínas adaptadoras, las CDPKs pueden ser fosforiladas por quinasas rio arriba de una vía de señalización o bien autofosforilarse. La autofosforilacion diferencial les permite reconocer sustratos específicos, alterando su capacidad de unión a una proteína blanco (Takeshi 2010). Un desafío en el estudio de estas enzimas es determinar cómo las quinasas estructuralmente relacionadas son capaces de reconocer su molécula blanco y fosforilarla, sin generar eventos de crosstalk. Nuestro modelo de estudio es la isoforma StCDPK3 de Solanum tuberosum. El objetivo de este trabajo es determinar si StCDPK3 es capaz de autofosforilarse en su dominio amino terminal, e intentar identificar las posiciones de los residuos serina y treonina fosforilados. Ensayos de actividad confirman que in vitro, StCDPK3 recombinante se autofosforila en presencia de calcio y esta actividad se inhibe con EGTA. Se realizaron electroforesis en geles bidimensionales utilizando la proteína recombinante en presencia de calcio y se detectaron mediante tinción con proQ, al menos 7 spots pertenecientes a la cadena de fosforilación. Los spots fueron enviados para su análisis al Intituto Pasteur de Montevideo a fin de identificar fosfopéptidos. Se realizó un western blot utilizando un anticuerpo anti-his para detectar la proteína recombinante, la cual posee un tag de histidinas, confirmándose la identidad de la misma.