Inform Cientifico Tecnico Final

LOUGE URIARTE ENRIQUE; VERNA ANDREA; MERCEDES GOIZUETA; ANDRES CASTELLANO; ALEJANDRA CAPOZZO; ERNESTO SPATH

2015-06-12/2019-12-12

Biológica

Sanidad animal

II.1. BALANCE ENTRE LOS OBJETIVOS PROPUESTOS INICIALMENTE Y LOS EFECTIVAMENTE ALCANZADOS A continuación se mencionan las actividades realizadas para alcanzar los objetivos: Materiales y métodos a) Suero 1 PI (vDVB-1a, 10 exp. 4,3 DICC50/ml); b) suero 2 PI (vDVB-1b ,10 exp. 3,57 DICC50/ml); c) diluciones seriadas (1/10) del suero 2 en suero ovino negativo. Los sueros (1 y 2) y las diluciones se utilizaron para optimizar la RT-PCR anidada y múltiple (RT-nPCR) de la región génica NS5B, utilizando primers diseñados (Gilbert et al., 1999). El ARN extraído (TRIzol®) del suero 2 y de las diluciones (1/10) se emplearon para evaluar concentraciones de primers y Cl2Mg (mezcla de PCR) y volúmenes de ADNc y producto de PCR (1° ronda). La sensibilidad analítica se evaluó en tres momentos. La especificidad analítica se determinó con cepas de referencia (NADL, Singer y VS253), muestras de fetos bovinos naturalmente infectados (incluido el vDVB), células MDBK y muestras de suero ovino negativas. Se evaluó la influencia de pooles de sueros en la sensibilidad analítica. Para ello se mezcló el suero 2 con iguales volúmenes de 4, 9, 19, 49 y 99 sueros negativos. De cada pool se extrajo ARN y se hizo RT-nPCR (3 veces). Además, se compararon las técnicas de RT-nPCR, RT-qPCR y FAL-ELISA con 31 sueros bovinos de archivos (Lab. de Virología, EEA Balcarce; IV, CICVyA, INTA Castelar) y de 60 sueros obtenidos de casos de diagnóstico. El aislamiento viral (AV) fue la técnica ?gold-standard?. Para la RT-qPCR se utilizaron los primers 324/326 (RT) y Pesti-qF/Pesti-qR (qPCR) (Mari et al., 2016). Las amplificaciones (ABI 7500) se hicieron con una master mix comercial (SYBR Green, Roche) por duplicado. Para la detección del producto (160 bp) se hizo un análisis de melting. Con la técnica RT-nPCR se analizaron 2791 muestras de suero bovino en 55 establecimientos (2015-2019). En el 40% de los mismos se recolectaron ≥ 50 sueros de distintas categorías. Además, se evaluaron 73 sueros de casos puntuales de diagnóstico (1-15 bovinos muestreados/caso). Resultados y conclusionesLas concentraciones óptimas fueron de 0,3 µM (primers) y 4 mM (Cl2Mg). El límite de detección viral (3,7 DICC50/ml) se obtuvo con 1,25 µl de ADNc y 2,5 µl de la 1º ronda de PCR, ambos en 25 µl de mezcla final. El gen NS5B se amplificó en todas las cepas (subtipos 1a, 1b, 2a y 2b). Los controles positivos (sueros de PI, individuales o en pooles) y negativos (suero ovino) tuvieron los resultados esperados. Todos los pooles (5, 10, 20, 50 y 100 muestras) resultaron positivos a la RT-nPCR. De los 91 sueros bovinos evaluados por diferentes técnicas, el nro. y la proporción (%) de muestras positivas fueron: a) AV [27 y 29,7% (CI 20,9 - 39,5)]; b) FAL-ELISA [45 y 49,5% (CI 39,3 - 59,6) ]; c) RT-nPCR [32 y 35,2% (CI 25,9 - 45,3)] y d) RT-rtPCR [34 y 37,4% (27,9 - 47,6)]. El % de detección por FAL-ELISA fue mayor con respecto al AV (p < 0,01) y a la RT-nPCR (p = 0,03), pero no difirió de la RT-rtPCR (p = 0,07). La detección de muestras positivas por AV fue menor con respecto a la RT-rtPCR (p = 0,049) y no difirió de la RT-nPCR (p = 0,35). No hubo diferencias entre las técnicas moleculares (p > 0,99). El % de acuerdo negativo fue elevado (media, 87%) para todas las técnicas. El % de acuerdo positivo fue elevado (media, 90%) para todas las técnicas diferentes al FAL-ELISA; fue moderado (media, 72%) cuando se incluyó esta última. La RT-nPCR tuvo óptima sensibilidad y especificidad analítica para utilizarse en planes de saneamiento. Las técnicas molecuales de RT-nPCR y RT-qPCR tienen similar desempeño para evaluar muestras de suero positivas al vDVB.El vDVB se detectó en el 2,4% (10/412) de los pooles; nro. de sueros positivos por pool: 1 suero (en 5 pooles), 2 sueros (4 pooles) y 3 sueros (1 pool). Un total de 16 muestras resultaron positivas: 13 de terneros neonatos de un campo de cría, con antecedentes de enfermedad de las mucosas (EM), y 3 de hembras de un tambo con pérdidas reproductivas. Un 18% (13/73) de los sueros obtenidos de casos puntuales resultaron positivos: 12 de bovinos de 6-12 meses y 1 de vaca. Estos animales provenían de 9 establecimientos, de los cuales en el 55% (5/9) se observaron signos cuadros compatibles con DVB/EM. Las prevalencias estimadas para bovinos infectados por el vDVB (1%, 29/2864) y para rodeos con presencia de animales infectados (20%, 11/55) son similares a estudios realizados en otros países.