Desarrollo de marcadores moleculares en base a estudios ómicos sobre dos progenitores de diferentes poblaciones base de un programa de mejoramiento genético de tomate

CACCHIARELLI, PAOLO; ELIZABETH, TAPIA; GUILLERMO RAÚL, PRATTA

Jornada; VI Jornadas de Ciencia y Tecnología 2021. Facultad de Ciencias Agrarias. Universidad Nacional de Rosario.; 2021

Desarrollo de marcadores moleculares en base a la secuencia del genoma de dos progenitorespertenecientes a un programa de mejoramiento genético en tomate.Cacchiarelli, Paolo1; Tapia, Elizabeth2; Pratta Guillermo R1.1Instituto de Ciencias Agrarias de Rosario (IICAR-CONICET/UNR).2 Centro Internacional Franco Argentinode Ciencias de la Información y Sistemas (CIFASIS-CONICET/UNR). cacchiarelli@iicar-conicet.gob.arEl tomate Solanum lycopersicum es una de las hortalizas más cultivadas y en los programas demejoramiento suele utilizarse el cruzamiento con un progenitor silvestre hacia el tomate cultivadopara obtener nuevas variedades mejoradas. A partir de experimentos previos, se logró obtener elgenoma y transcriptoma de los progenitores iniciales del programa de mejoramiento genético(PMG) de la especie. Estos genotipos discrepantes para caracteres de calidad de fruto, empleadoscomo progenitores de numerosas poblaciones de mapeo y mejoramiento genético fuerondesarrolladas por nuestro grupo de trabajo. A través de la obtención del genoma de estos materialesse logró saber la composición de la secuencia génica de los mismos, y a través del transcriptomaobtenido en los estados discrepantes de maduración, una lista de genes con expresión diferencial(ED). A partir de esta lista de genes con ED, se enfocó en una subfamilia de pequeñas proteínas dechoque térmico (sHSP, small Heat Shock Proteins) localizados en los cromosomas 6 (Chr6),previamente analizadas. En estos análisis previos, esta subfamilia de cuatro miembros(Solyc06g076570, Solyc06g076560, Solyc06g076540 y Solyc06g076520) sostienenaproximadamente el 57% del ARNm de sHSP total en la fruta roja madura. Estos 4 genes sHSP noposeen intrones y se encuentran duplicados en tándem dentro de una región de ~17,9 kb en elcromosoma 6 (Chr6). Analizando el RNAseq en estos genotipos se detectó expresión diferencialdurante la madurez del fruto para los transcriptos de estos miembros de sHSP localizadas Chr6, tallo observado en los análisis in silico. Estos resultados permitieron luego extraer y comparar estasregiones génicas de interés del cv. Caimanta (C) y la accesión silvestre LA0722 (P), utilizadas comoprogenitores del PMG. La comparación de estas regiones a través de un alineamiento de sussecuencias permitió poner de manifiesto los polimorfismos naturales que las diferencian. A partir deesto se detectaron 3 Inserciones/Deleciones y se desarrollaron marcadores moleculares (MM) deltipo InDel para la caracterización molecular. Los MM de tipo InDel son marcadores que detectaninserciones o deleciones provenientes de un genotipo o del otro. La población F4 es derivada delcruzamiento entre dos líneas mejoradas (ToUNR18xToUNR1) obtenidas en el PMG, en las que sesembraron en invernadero en bloques totalmente aleatorizados 12 plantas de 18 familias F4seleccionadas por caracteres de Peso (Pe) y Vida Poscosecha (VP) del fruto de maneraantagónica-divergente y se realizo su caracterización morfológica. La obtención de estos MM apartir de la comparación de las secuencias de ADN se realizo en la plataforma online Primer3(https://primer3.ut.ee/), con metodologia predeterminada y teniendo en cuenta que los parametros?any_th?, ?3'_th? y ?hairpin? tengan valores cercano al valor de cero, ya que son indicadores demarcadores de gran calidad y especificidad. Así se obtuvieron 3 InDels para caracterizarmolecularmente la población F4 segregante de tomate. La lista de InDels obtenida a partir de losanálisis llevados a cabo fue la siguiente:- InDel #1 Izquierdo: GATGTTCTGATGTCTGATGTAGTCT - Derecho:TGATTCTATTATGTATAAAGTAGCAGAGG - Amplicón de 402 bases de tamaño.Alinea/empareja con la región codificante del gen Solyc06g076550.4.1 - Diferencia de 14pb entre los genotipos- InDel #2 Izquierdo: TTAAGCCAGCAAATTAAACAACTGT - Derecho:AAATAAGGTTTTCATGTTTAGCCCT - Amplicón de 336 bases de tamaño.Alinea/empareja con la región promotora del gen Solyc06g076570.4.1 - Diferencia de 8 pbentre los genotipos- InDel #3 Izquierdo: GGATGATGGTGTGTAAGAATGATGA - Derecho:GTAAGCCTGCGAAGTTGAAATAATG - Amplicón de 559 bases de tamaño.Alinea/empareja con la región promotora del gen Solyc06g076570.4.1 - Diferencia de 16 pbentre los genotipos.Estos MM se amplificaron en termocicladores estándares a fin de llevar a cabo la reacción encadena de la polimerasa (PCR) y amplificar estas marcas de interés. Luego de estos, lasamplificaciones fueron visualizadas a través de geles de agarosa al 2,5% p/v en corridaselectroforéticas con buffer TAE en concentración de 1x y visualización mediante tinción conSYBR® Safe, a fin de obtener mejor discrepancia entre las bandas provenientes de los diferentescultivares. El análisis del patrón de bandas obtenidas mediantes estos MM de tipo InDels se analizócon el programa estadístico InfoStat, se realizo la prueba de normalidad y el análisis de la varianza(ANOVA) a un criterio de clasificación con el fin de detectar asociaciones entre mediante elcruzamiento de datos morfológicos y moleculares. Todas las variables en estudio dieron normal, asalvo peso, forma y L (estas fueron transformadas por Ln). El análisis ANOVA fue significativopara las variables altura , pH Y peso, manteniéndose con este comportamiento en los 3 InDelsdesarrollados y en las diferentes familias en estudio. Por otro lado, el análisis de las interaccionesfueron no significativas, por lo que el marcador mantuvo su efecto independientemente de la familiaque fue seleccionado. A partir de estos resultados, el grupo de investigación sigue desarrollandoMM del tipo SNP (Single Point Polimorfism) para validar el accionar de esta región particular deinterés agronómico y asociado a la calidad del fruto de tomate. Estudios previo en esta región deinterés demostró que es una región variable en el número y disposición de sus genes, en particularen las accesiones silvestre que presenta el germoplasma del tomate, por lo que en un futuro sellevará a cabo un experimento de secuenciación del tipo de lectura larga en estos genotiposprogenitores, con el fin de revelar de manera fiable la correcta disposición del arreglo de genes quese encuentra en dicha región. Para concluir con el trabajo, el estudio de esta población a través deenfoques del tipo -ómicos permitió el desarrollo y posterior análisis de marcadores moleculares queponen de manifiesto aquellas variantes que generan una ventaja en diferentes genotipos y familiasdentro del PMG con el fin de obtener nuevas variedades élites que satisfagan las necesidades delmercado