Desarrollo de una estrategia de purificación de proteínas utilizando un péptido bifuncional

LEOPOLD, MARÍA JESÚS; OGGERO, MARCOS; CEAGLIO, NATALIA

Posadas, Misiones

Simposio; 6º Simposio Argentino de Procesos Biotecnológicos (SAPROBIO); 2021

Simposio Argentino de Procesos Biotecnológicos - Universidad Nacional de Misiones

Entre las técnicas que permiten la obtención de proteínas puras en un único paso se puede mencionar a la cromatografía de inmunoafinidad que emplea etiquetas peptídicas que contienen epitopes lineales reconocidos por anticuerpos monoclonales (mAb). Esta interacción suele presentar alta afinidad y especificidad, lo que minimiza el riesgo de uniones inespecíficas. En nuestro laboratorio hemos diseñado un péptido de 15 aminoácidos denominado mGMOP como etiqueta para la preparación de proteínas de fusión. Esta etiqueta deriva de la región N-terminal del factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos humano (hGM-CSF) y se caracteriza por exhibir dos propiedades. Por un lado, presenta una elevada probabilidad de O-glicosilación, con 6 sitios potenciales para la unión de O-glicanos. Por otra parte, contiene la secuencia APAR, que constituye un epitope lineal reconocido por un mAb (CC1H7) obtenido también en nuestro laboratorio. Ambas características determinan la bifuncionalidad del péptido mGMOP, que puede ser utilizado simultáneamente para conferir propiedades biológicas mejoradas a las proteínas de fusión debido a su capacidad de híper-O-glicosilación y como un sistema para la cuantificación y/o purificación de las mismas. Trabajos previos permitieron fusionar la etiqueta mGMOP a la región N-terminal del interferón-α2b recombinante humano (rhIFN-α2b), demostrando la quimera mGMOP-IFN una mejora significativa en sus propiedades farmacocinéticas con respecto al rhIFN-α2b no modificado (Sales y col., 2021). En el presente trabajo se propuso explotar el potencial de la etiqueta mGMOP para ser utilizada para la purificación de mGMOP-IFN a partir de sobrenadantes de cultivo de células CHO-K1 recombinantes mediante cromatografía de inmunoafinidad. Teniendo en cuenta que se ha demostrado un aumento de la afinidad de unión entre el epitope APAR-paratope CC1H7 en un entorno de alta fuerza iónica (Perotti y col., 2013), se llevó a cabo un diseño de experimentos con el fin de estudiar el efecto de diferentes sales a distintos pH mediante ELISA. De esta manera, se establecieron tres condiciones (KCl 3,75 M pH 7,5; NaCl 4,5 M pH 7,5; Na2SO4 1 M pH 8) observándose el máximo incremento de la afinidad aparente con respecto al control en ausencia de sal a pH 7. Las condiciones seleccionadas se evaluaron como estrategias de unión en el proceso de purificación cromatográfico. Para ello, se analizó la capacidad dinámica de la matriz Sepharose-CC1H7 mediante acondicionamiento de la siembra (sobrenadante conteniendo mGMOP-IFN) con las diferentes sales al pH correspondiente, comparando los resultados con el mismo proceso realizado en ausencia de sal. La capacidad dinámica a C/C0=0,1 fue superior para la condición Na2SO4 1 M pH 8 con respecto a la siembra en ausencia de sal (3,2 veces), mientras que para el resto de las sales fue similar a esta última condición. No obstante, a relaciones C/C0>0,1 se observaron diferencias para todas las sales con respecto a la unión en ausencia de sal, indicando que la condición de alta fuerza iónica permite incrementar la masa de mGMOP-IFN a sembrar y resulta así, una estrategia eficaz para optimizar el proceso de purificación de proteínas de fusión al novedoso péptido.