Evaluación de un ensayo de amplificación isotérmica mediada por bucles (LAMP) para detectar el gen stx2 en aislamientos clínicos de Escherichia coli en Argentina

CARLOS LEIVA; RIVERO, R; REDONDO, L M; FERNANDEZ MIYAKAWA, ME; ROGE, A

San Miguel de Tucuman

Simposio; X Simposio Nacional de Biotecnología REDBIO Argentina 2015; 2015

RedBio Argentina

Escherichia coli productor de toxina Shiga (STEC del inglés Shiga toxin-producing Escherichia coli) esun patógeno de transmisión alimentaria que puede producir enfermedades en humanos tales comodiarreas hemorrágicas así como síndrome urémico hemolítico (SUH). Dos tipos diferentes de toxinas Shiga han sido descriptos (Stx1 y Stx2) que junto a otros factores de virulencia facilitan lacolonización efectiva en el tracto intestinal y ocasionan las enfermedades antes mencionadas.Argentina presenta valores de incidencia altos de HUS a nivel mundial por lo que, en este sentido, eldesarrollo de herramientas de detección rápidas y apropiadas que puedan suplementar o reemplazarlos métodos existentes se convierte en una necesidad. Actualmente, con el fin de identificar STECexisten ensayos de amplificación de ácidos nucleicos tales como PCR. Sin embargo, el uso decostosos termocicladores es un requisito indispensable, lo cual limita su amplia aplicabilidad. Laamplificación isotérmica mediada por bucles (LAMP del inglés Loop-mediated isothermalamplification) es un método de amplificación de ácidos nucleicos simple, específico, económico yrápido en comparación con el ensayo de PCR convencional. De esta manera, en el presente trabajose evaluó el ensayo LAMP para la detección del gen stx2 de E. coli y se compararon los resultadosobtenidos con el ensayo de PCR convencional.La mezcla de reacción de LAMP (25 μl) consistió en buffer de reacción ThermoPol 1X (New EnglandBiolabs), MgCl2 5 mM, 1,4 mM de cada dNTP (Invitrogen), primers internos FIP/BIP 1,8 mM, primersexternos F3/B3 0,1 mM, primers de unión al bucle LF/LB 1 mM, ADN polimerasa Bst 2.0 WarmStart 8U (New England BioLabs) y 2 μl de ADN molde. La reacción fue llevada a cabo en un termobloque a65°C durante 60 min. y posteriormente a 80°C para terminar la reacción. El producto de amplificaciónfue detectado a simple vista mediante el agregado de 1 μl SYBR® Green I 1000X (Invitrogen), asícomo también mediante electroforesis en gel de agarosa (1,5%) junto con la posterior tinción conbromuro de etidio y visualización bajo luz UV.De un total de 61 aislamientos de E. coli analizados, no se observaron resultados falsos positivos nifalsos negativos mediante el ensayo LAMP. Para determinar la especificidad del ensayo LAMP, fueronusadas como controles negativos diferentes especies de bacterias, incluyendo Salmonella, Shigella yEscherichia coli no-productor de toxina Shiga. Cuando el reactivo SYBR® Green I fue agregado, elcolor de la solución fue verde en las reacciones positivas, mientras que en las reacciones negativasse mantuvo naranja. A su vez, al revelarse las muestras positivas mediante electroforesis en gel deagarosa se observó el patrón ¨escalonado¨, característico de las reacciones LAMP.En este sentido, mediante el ensayo LAMP se obtuvo una especificidad de 100% en comparación conel ensayo de PCR convencional. Nuestros resultados demuestran que el ensayo LAMP es unaherramienta rápida, específica y eficiente para la detección del gen stx2 en E. coli aisladas a partir demuestras clínicas. Probamos que LAMP sólo requiere el uso de un termobloque sin el requerimientode equipos de alto costo como termocicladores y transiluminadores. De esta manera, la inspección deresultados puede llevarse a cabo a simple vista sin la necesidad de realizar electroforesis en gel. Enconclusión, el ensayo LAMP resulta adecuado como herramienta adicional de detección paralaboratorios clínicos sin acceso a equipamiento sofisticado y costoso.