Diagnóstico de Brucelosis por LAMP-PCR en muestras de leche

DAILOFF, G; RIZZI, M; RUFFET, C; CONDE, S; REDONDO, L M; FERNANDEZ MIYAKAWA, ME; GARBACCIO, S; HASENAUER, F; DE LA FUENTE, I ; SAMARTINO, L

Ciudad Autonoma de Buenos Aires

Congreso; XIII Congreso Argentino de Microbiologia; 2013

Asociacion Argentina de Microbiologia

La brucelosis es una enfermedad infecciosa que afecta tanto a los animales como al hombre constituyendo una clásica zoonosis. El ganado bovino es afectado principalmente por B. abortus y en menor grado por B. melitensis y B. suis. El método LAMP resulta muy útil para aquellos establecimientos donde no se cuenta con un termociclador para realizar diagnóstico por PCR, ya que la reacción puede ser llevada a cabo a una temperatura constante entre 60-65°C (en nuestro caso se utilizó 63ºC) durante una hora en un termobloque o baño maría. Esto se debe a la utilización de la ADN polimerasa Bst (Bacillus stearothermophylus) que presenta actividad de desplazamiento de cadena (evitando las temperaturas de desnaturalización) y utiliza dos pares de primers (dos externos F3 y B3 y dos internos FIP y BIP). El objetivo fue poner a punto un método de diagnóstico molecular denominado amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP). Se utilizaron 102 muestras de leches de pooles de tambos. Como ensayos previos se realizó el diagnóstico serológico mediante I-ELISA. La puesta a punto de LAMP, para la detección de Brucella sp., se realizó utilizando como base para diseño de los primers, la secuencia del gen omp25. Para comparar los resultados se utilizó PCR con primers B4-B5 y con primers F3-B3, esta última se realizó también para verificar el funcionamiento de los primers a utilizar en LAMP. Como controles positivos de las técnicas moleculares se utilizaron B. abortus cepa S19 y S99. En el diagnóstico serológico utilizando I-ELISA se observó que 9 de las 102 muestras resultaron positivas. Todas las amplificaciones fueron detectadas mediante la corrida en gel de agarosa al 2% observandose una banda de 223 pb para la PCR con primers B4-B5 y una banda 218 pb para la PCR con primers F3-B3, conservándose el mismo estatus. En el caso de LAMP, los productos se pudieron apreciar como un chorreado de bandas, obteniéndose los mismos resultados. También fue detectado mediante visualización a simple viste por la adición de bromuro de etidio al tubo de reacción y observándose su fluorescencia bajo la luz UV. Finalmente, para verificar la amplificación, el producto de LAMP fue digerido con enzima de restricción Alu I visualizándose una banda 100 pb. Como conclusión la técnica de LAMP resulta simple y económica, pudiéndose comprobar que no requiere el uso de instrumental específico, para amplificar los ADN, siendo muy útil para aquellas instituciones que no cuentan con el equipamiento necesario, termociclador, para realizar diagnóstico molecular por PCR. También se pudo observar si hubo amplificación a simple vista, sin la necesidad de realizar una corrida electroforética.