"Búsqueda de factores celulares antivirales a través de ensayos de alto rendimiento"

C. C. GARCÍA

Buenos Aires

Congreso; X Congreso Argentino de Virologia; 2011

SAV

El virus dengue (DENV) es un arbovirus de la familia Flaviviridae que presenta cuatro serotipos (DENV-1 a DENV-4) y son transmitidos al hombre por mosquitos del género Aedes. La infección resulta en un amplio espectro clínico que abarca desde infecciones inaparentes, hasta formas más severas de fiebre hemorrágica de dengue y síndrome de shock de dengue. En la actualidad no hay vacunas ni agentes quimioterapéuticos específicos disponibles para prevención o tratamiento del dengue, por lo que representa una de las prioridades en el desarrollo de antivirales. Con el objetivo de identificar factores celulares antivirales, en el presente trabajo se propuso el uso combinado de microarreglos (microarrays) en conjunto con el mecanismo de interferencia de ARN, a través de ensayos de alto rendimiento (high throughtput screening). En primer lugar, se utilizaron microarreglos de ADN para analizar la expresión génica de varias líneas celulares infectadas con DENV-2. A partir de los perfiles obtenidos en las muestras fueron identificados 75 genes relacionados con la inmunidad innata que resultaron estar sobreexpresados en todas las líneas celulares luego de 24 y 48 horas post infección. Luego, en forma complementaria se utilizaron vectores lentivirales que expresan pequeños ARN con estructura de horquilla (small hairpin RNAs, shRNAs) con el fin de silenciar la expresión de los mismos y definir así su potencial antiviral. Para ello, se pusieron a punto las condiciones que permitieran la transducción de células con 5 shRNAs redundantes dirigidos hacia cada uno de los 75 genes, seguido de una infección con DENV-2, a través de ensayos de alto rendimiento utilizando un sistema automatizado provisto por el Broad Institute (EEUU). Los resultados se analizaron mediante ensayos de inmunofluorescencia indirecta revelando la expresión de la proteína NS3 del virus dengue, y por RT-PCR cuantitativa detectando genoma viral. A partir de este nuevo estudio, se identificaron 23 genes con propiedades antivirales. Algunos de estos genes ya habían sido identificados por otros grupos de investigación, como PKR, RIG-I, IFITM2, CASP3, sin embargo el análisis también reveló nuevos genes como TRIM19, GMPR, DUSP5, CD38, IFI27, IFI35, GBP1, SP110, IFI6, que constituyen interesantes perspectivas de investigación en el campo antiviral. En particular, nuestro grupo de trabajo se ha enfocado en estudiar el rol de TRIM19 (proteína de la leucemia promielocítica, PML) en la infección con DENV. Los ensayos preliminares demuestran que esta proteína podría cumplir una función antiviral clave en la progresión del ciclo de replicación de DENV, por lo que concluimos que la combinación del análisis aleatorio de la respuesta génica de células infectadas (microarreglos), en conjunto con el silenciamiento de genes mediante shRNAs, constituyen un abordaje muy útil en ensayos de alto rendimiento para caracterizar nuevos factores celulares antivirales.