Estudios preliminares para el desarrollo de oligobodies contra proteínas prionicas bovinas, PrPC , PrPSc y PrP recombinante

VALDIVIESO A. GABRIEL; TAMINELLI GUILLERMO; REYES G. BEATRIZ; DANKERT MARCELO A.; SANTA COLOMA TOMÁS A.

Mar del Plata, Buenos Aires, Argentina

Congreso; 50 Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Investigación Clínica; 2005

SAIC

Los oligobodies (Obs) son reactivos sintéticos basados en oligonucleótidos capaces de reconocer proteinas y que pueden llegar a tener una especificidad similar a los anticuerpos. Como son oligonucleótidos simples, pueden ser amplificados por PCR, lo cual aumenta los límites de detección a los niveles de los métodos de detección por PCR, algo imposible de obtener con anticuerpos. El objetivo primario de éste trabajo fue desarrollar Obs policlonales contra péptidos sintéticos correspondientes a diferentes regiones de PrP celular bovina (PrPC) y probarlos en su habilidad para reconocer PrPC y PrP recombinante (rPrP). Se diseñaron tres péptidos sintéticos correspondientes a diferentes regiones de la proteína PrP bovina para seleccionar diferentes Obs policlonales contra PrPC (proteína glicosilada) y rPrP bovinas (proteína no glicosilada). Para seleccionar los Obs, se construyeron diferenes librerías de oligonucleótidos de secuencia al azar (entre 55 y 75 mer) con secuencias concenso en cada extremo para poder amplificar los oligonucleótidos seleccionados por PCR. Las selecciones iniciales se realizaron incubando membranas saturadas con los péptidos sintéticos blanco y librería simple cadena, se realizaron lavados y los oligonucleótidos eluídos fueron amplificados por PCR con uno de los primers marcado con biotina, obteniendose los Obs policlonales para cada uno de los diferentes péptidos sintéticos. Los Obs contra los diferentes péptidos fueron probados en su habilidad para reconocer las proteínas PrPC y rPrP bovina usando una mezcla de proteínas totales mediante Western blots utilizando estreptavidina-fosfatasa alcalina como sistema de revelado. Como resultado se obtuvieron Obs policlonales capaces de reconocer rPrP (50 ng) en Western blot, y aunque su especificidad no resultó ser la óptima, podrían ser usados directamente para pruebas in vivo si se agrega un paso previo con proteinasa K, que destruye tanto la proteína PrP nativa como las demás proteína celulares, pero no afecta a la proteina PrPSc infecciosa.