FALSOS NEGATIVOS POR PCR EN EL DIAGNOSTICO PRECOZ DE LA INFECCION POR HIV-1: IMPLICANCIA DE LOS SUBTIPOS VIRALES.

P AULICINO,; M BATALLA,; M GOMEZ CARRILLO,; A. MARTINEZ PERALTA,; M AVILA,; L SEN.

Buenos Aires,

Congreso; VII Congreso Argentino de Virología,; 2002

Sociedad Argentina de Virología

Introducción: El diagnóstico precoz de la infección por HIV-l en niños menores de 1 a meses nacidos de madres HIV positivas se realiza desde 1996 en nuestro laboratorio por medio de una multiplex nested PCR (nPCR) en la cual se amplifican 2 fragmentos virales correspondientes a los genes gag (131pb) Y env (372pb) ¡unto a un fragmento celular del gen estructural beta­actina (S43pb) usado como control de amplificación. El entena usado para el diagnóstico de infección por HIV-l es la presencia de al menos un gen viral junto a beta actina en dos muestras consecutivas del paciente. El diseño de la nPCR se baso en secuencias pertenecientes al subtlpo B. predominante en EEUU y Europa hasta mediados de los años ´90 y previo al descubrimiento de las recombinantes BF en Argentina. Objetivo: Estudiar las causas a nivel genotípico del HIV­1 en especial el subtipo viral que pudieran ser responsables de la falta de amplificación de los genes virales por nPCR usada para diagnóstico en tres casos falsos negativos y en 19 casos donde solo se amplificó repetidamente uno y el mismo de los genes virales junto al gen de beta­actlna. Para la determinación del subttpo viral se utilizó la técnlca de Ensayo de Movilidad de Heteroduplex (HMA) para los genes gag (460pb) y env (700pb), y se complementó el estudio mediante la amplificación, secuenciación y análisis filogenético de un fragmento de 600pb correspondiente al gen vpu y la región 5´del env, Resultados: De 1996 a marzo de 2002. 277 niños fueron diagnosticados HIV-l positivos de un total de 1309 estudiados por nPCR, Tres de ellos confirmaron la infección por serologia y alta carga viral en plasma pasados los 1 a meses de edad pero fueron falsos negativos por nPCR al no amplificar ninguno de los genes virales en repetidas ocasiones. Sorprendentemente se encontró que uno de los falsos negativos pertenecía al subtipo A, nunca antes reportado en Argentina, De los 2 restantes, el subtipo pudo ser determinado solo en 1 perteneciendo al subtlpo F tanto en gag como en env. Los resultados obtenidos al subtipificar las cepas de los 13 pacientes que solo amplificaron el fragmento gag por nPCR fueron los siguientes: 1/13 subtlpo A (gag), 6/13 subttpo F (gag), 4113 subtipo F (gag y env), 2/13 no determinados. En los 6 pacientes que amplificaron solo el gen env por nPCR los resultados fueron: 216 subtipo F (gag), 1/6 subtipo B (gag)lF(env), 1/6subtipo F(gag)l8(env), 1/6 subtipo F (gag yenv), 1/6 subtipo C (gagVBenv), Con el objeto de discernir entre subtipos F puros y recombinantes BF, se secuenció un fragmento de 600pb del gen vpu y porción 3´del env determinado como la región mas probable de encontrar un sitio de recombinación. Luego del análisis filogenético, se demostró que un 69% de las cepas caracterizadas como subtipo F por HMA eran en realidad recombinantes BE El punto de recombinación fue determinado en todos los casos por medio del programa para analisis de secuencias SlmPlot y confirmado por construcción de arboles de filogenia utilizando los programas incluidos en el paquete PHYUP, Conclusiones: Todos los casos analizados en el presente estudio, seleccionados por no amplificar alguno de los genes virales en la nPCR diagnóstica pertenecen a subtipos no-B. Algunos de ellos incluso pertenecen a subtipos raros nunca antes encontrados en nuestro país, Estos resultados son altamente indicativos de que cambios a nivel subtipo en el genoma viral podrían ser los responsables de la falta de amplificación observada, Dada la alta variabilidad del HIV-1 y el incremento de las corrientes migratorias a nivel mundial, se plantea la necesidad de un monitoreo y alerta continuo con el fin de evitar que nuevas variantes en surgimiento escapen al diagnóstico molecular.