Farmacocinética de moléculas de rhIFN-alfa2b modificadas mediante glicoingeniería

NATALIA CEAGLIO; MARCOS OGGERO; MARINA ETCHEVERRIGARAY; RICARDO KRATJE

Buenos Aires. Argentina

Congreso; XI Congreso Argentino de Farmacia y Bioquímica Industrial. JorFyBI IX Jornadas de Farmacia y Bioquímica Industrial; 2007

Sociedad Argentina de Farmacia y Bioquímica Industrial (SAFyBI)

INTRODUCCIÓN: Los interferones (IFNs) son un grupo de citoquinas que, si bien se definen por su capacidad de conferir resistencia a las infecciones virales, poseen otras funciones biológicas, como la inhibición de la proliferación y la modulación de la diferenciación celular. El IFN-alfa2b humano recombinante se emplea clínicamente para el tratamiento de numerosas enfermedades virales y tumorales. No obstante, su corta vida media en plasma demanda la administración de dosis elevadas y frecuentes, con la aparición de efectos colaterales y, en consecuencia, el deterioro de la calidad de vida del paciente. Se han desarrollado numerosas estrategias para disminuir el clearance del rhIFN-alfa2b, las cuales apuntan al aumento del tamaño molecular con el fin de reducir la filtración glomerular, principal mecanismo de eliminación de la citoquina. En el presente trabajo se propone la aplicación de una estrategia de glicoingeniería mediante la introducción de sitios potenciales de N-glicosilación en el rhIFN-alfa2b, con el objeto de aumentar el tiempo de residencia de la citoquina en plasma, de manera de incrementar su actividad biológica in vivo y reducir la frecuencia y las dosis aplicadas.                         MATERIALES Y MÉTODOS: La introducción de sitios potenciales de N-glicosilación en el rhIFN-alfa2b se realizó mediante mutagénesis sitio-dirigida en su variante extensión por solapamiento. Se construyeron 14 mutantes con un sitio de N-glicosilación en diferentes posiciones de la molécula, evitando comprometer la estructura y función de la proteína. Las variantes fueron clonadas en plásmidos de expresión para células eucariotas y producidas en forma transitoria en células CHO. Teniendo en cuenta la conservación de al menos un 80% de la actividad biológica específica del rhIFN-alfa2b wild type (200 UI.ml-1) y el grado de glicosilación de las muteínas, se seleccionaron cinco posiciones aminoacídicas (4, 23, 70, 77 y 113) para la construcción de análogos con dos a cinco sitios de N-glicosilación. Se obtuvieron clones celulares productores de cada una de las variantes de rhIFN-alfa2b y las mismas se purificaron mediante cromatografía de inmunoafinidad. La evaluación farmacocinética se realizó en ratas Wistar hembras, mediante la inyección subcutánea de 5.105 U.kg-1 de peso corporal de cada una de las muteínas de rhIFN-alfa2b. Se recolectaron muestras de sangre a diferentes tiempos post-inyección y se determinó la actividad biológica antiviral mediante un ensayo de inhibición del efecto citopático del virus VSV sobre células MDBK. La curva de concentración plasmática en función del tiempo se ajustó a un modelo bicompartimental, con el fin de obtener los siguientes parámetros farmacocinéticos: tiempo de vida media de la fase de eliminación (t1/2), área bajo la curva (AUC), clearance aparente (Clapp), concentración plasmática máxima (Cmáx) y tiempo para alcanzar dicha Cmáx (Tmáx). RESULTADOS Y CONCLUSIONES: La estrategia de glicoingeniería permitió incrementar la masa molecular mediante la adición de nuevos sitios de N-glicosilación. El estudio farmacocinético demostró un comportamiento similar para las moléculas con cuatro y cinco sitios de N-glicosilación, las cuales exhibieron un t1/2 25 veces superior y un Clapp 20 veces inferior con respecto a la molécula no glicosilada. De esta manera, las moléculas hiperglicosiladas demostraron una notable mejora en las propiedades farmacocinéticas comparadas con las del IFN-alfa original, permitiendo proyectar un producto que combine menor frecuencia en su administración con mayor eficacia terapéutica.