Función biológica de la histona H2B.Z de Toxoplasma gondii

MUÑOZ DANIELA; GANUZA AGUSTINA; ANGEL SERGIO O.; VANAGAS LAURA

Resistencia

Encuentro; XXX Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Protozoología; 2018

SOCIEDAD ARGENTINA DE PROTOZOOLOGÍA (SAP)

Toxoplasma gondii es un parásito intracelular obligado de humanos y animales, perteneciente al Phylum Apicomplexa. Los moduladores epigenético y la alteración de la estructura de la cromatina son muy importantes en la regulación de la expresión génica, la replicación y el mecanismo de reparación del ADN. Las histonas canónicas y variantes son componentes principales de la cromatina. H2B.Z es una histona variante única de Apicomplexa que conforma nucleosomas con H2A.Z en T.gondii, posicionándose mayormente en promotores de genes transcripcionalmente activos. Ambas histonas son modificadas post-traduccionalmente y nuestra hipótesis es que esta regulación epigenético es fundamental para el pasaje de estadio taquizoito a bradizoito. Para determinar la importancia biológica de H2B.Z y de sus acetilaciones N-terminales obtuvimos parásitos que sobre-expresan la histona salvaje (c-Myc-WT) o mutantes: con las 5 lisinas acetilables mutadas ya sea por alaninas (c-Myc-A) (amino ácido neutro) o por argininas (c-Myc-R) (amino ácido con carga positiva), todas ellas etiquetadas con c-Myc. Los parásitos no mostraron diferencias significativas en su tasa de replicación, pero observamos un aumento de la tasa de diferenciación para la mutante c-Myc-R comparada con el parental, y una disminución de la misma en la mutante c-Myc-A. Dado que H2B.Z es esencial para la sobrevida del parásito, decidimos realizar la disrupción génica del gen endógeno mediante el sistema CRISPR/CAS9, en los parásitos que sobre-expresan las histonas mutadas. Para esto, se diseñaron sgRNAs de 20-40 nucleótidos del marco de lectura abierto del gen H2B.Z de la región N-terminal. Se co-transfectaron los parásitos con el vector y un amplicón portando el cassette de selección de DHFR + regiones de homología con el 3´y 5´UTR de la histona endógena para inserción disruptiva por doble recombinación homóloga. La eficiencia de la transfección fue analizada por Inmunofluorescencia Indirecta. Se seleccionaron los parásitos con pirimetamina y luego de 3 pasajes se clonaron por dilución límite. Los clones fueron analizados por PCR y Western Blot, además de enviarse a secuenciar. Los ensayos fenotípicos preliminares muestran un aumento en la tasa de diferenciación para los parásitos c-Myc-R, cuya histona endógena fue delecionada. En conclusión, las acetilaciones en el N-terminal de la histona H2B.Z tendrían una función importante en el proceso de diferenciación del parásito.