Métodos de obtención de celomocitos de E. fetida para ensayos ecotoxicológicos

FUCHS, JULIO S.; PIOLA, LUCAS; ONETO, MARÍA LUISA; CASABÉ, NORMA B.; KESTEN, EVA

Buenos Aires - Arg

Jornada; XXIV Jornadas Interdisciplinarias de Toxicología. III Jornadas Rioplatenses de Toxicología.; 2004

Asociación Toxicológica Argentina

 Algunos de los biomarcadores desarrollados en nuestro laboratorio (Tiempo de Retención del Rojo Neutro –TRRN-, Ensayo Cometa), requieren la obtención de celomocitos de Eisenia fetida, en forma no destructiva. En el presente trabajo se comparan tres métodos de obtención de estas células: 1) punción de la cavidad celómica; 2) extrusión por excitación eléctrica y 3) extrusión en un medio irritante. Focalizamos nuestro estudio en la viabilidad celular, el número de células obtenidas y la utilidad práctica del método para los ensayos posteriores de biomarcadores.  Las células se obtienen en el método 1), insertando una aguja hipodérmica en la cavidad celómica y extrayendo el fluido celómico con una jeringa que contiene 50 ul de solución Ringer. En el método 2), cada lombriz, colocada en un tubo con 1.5 ml de PBS pH=7.4, se estimula eléctricamente a 6 V, 3 veces durante menos de 15 seg. cada vez. En el método 3), la extrusión se logra sumergiendo cada lombriz en 1.5 ml de un medio que contiene solución salina, etanol, EDTA y guayacol glicerol éter, pH=7.3-7.6, durante 1 min. Las células obtenidas se tiñen con Azul de Tripán y se observan al microscopio para evaluar viabilidad, número y tipo de células.  Los tres métodos ensayados dieron alta viabilidad celular: 95.4 ± 2.3; 97.3 ± 0.4 y 98.5 ± 1.0 %, para los métodos 1), 2) y 3) respectivamente, sin diferencias significativas entre ellos. En cuanto al número total de células/lombriz, con el método 1) se obtuvieron 8.9 ± 1.6 x 104 cél.; por el método 2), 2.5 ±  0.5 x 106 cél., y empleando el método 3), 6.0 ±  1.1 x 106 cél., observándose diferencias significativas entre ellos (p< 0,05). El método por punción de la cavidad celómica resulta el menos eficiente en cuanto a rendimiento celular.  Si bien el número de células obtenidas por extrusión con medio irritante es el más alto, el método que emplea excitación eléctrica ofrece las ventajas de producir suspensiones con menor cantidad de sustancias químicas agregadas que podrían interferir en ensayos posteriores. Además por ser más sencillo, rápido y económico, resulta una alternativa útil para la obtención de celomocitos de E. fetida en los ensayos de TRRN y Cometa, biomarcadores no específicos de estrés ambiental. Agradecimientos: A la UBA por los subsidios X008/2001y X208/2004.