EVALUACIÓN DE LA CONSERVACIÓN DE PLACAS DE ELISA TAPIZADAS CON LA PROTEÍNA RECOMBINANTE SAG1 PARA DIAGNÓSTICO DE NEOSPOROSIS

NOVOA M.B.; AGUIRRE N.P.; SARLI M.1,2 ; ECHAIDE I.E.; SIGNORINI M.L.; PRIMO M.E.

La Plata

Congreso; XII Jornadas y Reunión Anual de la Asociación Argentina de Inmunología Veterinaria; 2019

La neosporosis es una enfermedad parasitaria causada por Neospora caninum, un protozoario intracelular obligado. Provoca abortos en vacas y lesiones neurológicas en terneros. La prueba de referencia para el diagnóstico es la inmunofluorescencia indirecta (IFI). Dado que es una técnica subjetiva y laboriosa, se desarrollaron enzimoinmunoanálisis (ELISA), objetivos y automatizables, utilizando lisados de taquizoitos. En el Laboratorio de Inmunología y Parasitología Veterinaria del INTA Rafaela, se desarrolló un ELISA de competición (ELISAc) basado en la proteína recombinante SAG1 y el anticuerpo monoclonal (AcM) P1C2D8F8 (ELISAcSAG1t). El objetivo del presente trabajo fue evaluar diferentes tratamientos para la conservación de las placas de ELISA tapizadas con la proteína recombinante SAG1. Se tapizaron 26 placas de ELISA con 1 µg de SAG1 por pocillo, diluido en PBS hasta una concentración de 0,02 µg/ μl, y se incubaron a 4ºC durante 16 h. Luego las placas se dividieron en 4 grupos: GA (n= 10) se lavaron 2 veces con PBS; GB (n= 10) se bloquearon con PBS con 10% de leche descremada (PBS-L) y se lavaron con PBS con 0,05% de tween 20 (PBS-T); GC (n= 4) se bloquearon con PBS-L, se lavaron con PBS-T y se incubaron con 100 µl de un líquido sellador de placas de ELISA (Candor, Alemania); y GD (n= 2) o grupo control fueron utilizadas en el día. Todas las incubaciones se realizaron a 25ºC durante 40 min. Luego, las placas de los GA, GB y GC se envasaron al vacío y se almacenaron a 4ºC durante un año. Cumplido el tiempo de almacenamiento, las placas del GA se bloquearon con PBS-L, se lavaron PBS-T y luego se procesaron en paralelo con las placas de los GB y GC. Los sueros y controles se analizaron por duplicado diluidos 1:2 en PBS-L-T. En cada placa se utilizaron 4 controles: i) suero positivo fuerte, ii) suero positivo débil, iii) suero negativo y iv) sin suero (control de conjugado, Cc); y se analizaron 44 sueros de bovinos previamente clasificados por IFI (22 sueros negativos y 22 positivos). Los resultados se expresaron en porcentaje de inhibición (%I) según la fórmula: %I =100- [(DOmuestra/ DOCc) x 100]. El punto de corte del ELISAcSAG1t, establecido previamente, fue ≥29 %I. Se compararon los %I de las muestras analizadas en las placas de los grupos GA, GB y GC con los del GD utilizando el test de Wilcoxon para datos pareados. Los resultados clasificados como positivos o negativos se compararon utilizando el test de McNemar. Los %I de los sueros analizados en las placas del GA y GB fueron significativamente diferentes a los %I obtenidos cuando los mismos sueros fueron analizados en las placas del GD (P= 0,006 y P< 0,001, respectivamente). La diferencia también fue significativa cuando se compararon los resultados positivos o negativos según el punto de corte (P< 0,001). En las placas del GA se afectó la sensibilidad (9 resultados falsos negativos) y en las placas del GB disminuyó la especificidad (2 resultados falsos positivos). En cambio, no hubo diferencia significativa entre los %I de los sueros analizados en las placas del GC y GD (P= 0,673) y la concordancia en los resultados fue del 100 % (P= 1). Los resultados obtenidos demuestran que la estrategia de conservación de las placas del GC: tapizado, bloqueo, sellado y envasado al vacío a 4ºC constituye una opción de conservación adecuada de las placas para su producción y posterior distribución en formato de kits de diagnóstico. La posibilidad de almacenar placas de ELISA, permitirá transferir la técnica a otros laboratorios.