Aislamiento del virus de la Diarrea Viral Bovina (vDVB) en ovocitos bovinos madurados e infectados in vitro

GONZÁLEZ ALTAMIRANDA; VERNA AE; KAISER GG; LEUNDA MR; CAMPERO CM; ODEÓN A

Madrid

Congreso; World Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians-14th International Symposium, Madrid, Spain, 17-20 June 2009; 2009

Introducción El virus de la Diarrea Viral Bovina (vDVB) es uno de los patógenos causante de desordenes reproductivos en los bovinos (1, 2). El uso de tecnologías de reproducción asistida, como la producción de embriones in vitro (PIV) ha permitido mejorar la productividad bovina en todo el mundo. Sin embargo, la PIV de embriones mantiene un potencial riesgo de contaminación con vDVB si los ovocitos provienen de hembras persistentemente infectadas o que han cursado una infección aguda (3). A pesar de que existen numerosos estudios sobre los efectos de la interacción del vDVB con las primeras etapas del embrión, poco se conoce sobre los mecanismos tempranos de interacción entre el virus y el ovocito. Si bien recientemente se ha avanzado en el entendimiento de las variables que operan en la transmisión de enfermedades a través de la transferencia de embriones (TE) producidos in vivo, no se dispone de suficiente información referida a los riesgos epidemiológicos involucrados en los embriones producidos in vitro (2, 4, 5). El objetivo de este trabajo fue evaluar si el vDVB es capaz de infectar ovocitos bovinos durante su maduración in vitro. Materiales y Métodos Obtención, lavado e infección de los ovocitos: Un total de 100 ovocitos fueron obtenidos a partir de ovarios de matadero por aspiración folicular. Se infectaron al momento de iniciar su maduración in vitro con una cepa no citopatica del virus (108 TCID50/ml). La coincubación de 20 horas se realizó en medio de maduración (TCM-199 modificado, suplementado con r-hFSH + 10% de suero fetal bovino) a 38.5°C, 5% de CO2 y humedad a saturación. Luego de este periodo se realizó la remoción de las células de granulosa y zona pelúcida por medio de enzimas (hialuronidasa y pronasa respectivamente) y pipeteo. Los ovocitos sin zona pelúcida fueron lavados en medio de maduración (3 x 1 minuto) y una muestra del último pasaje utilizada como control. Aislamiento viral: Los ovocitos procesados, las células de la granulosa y el medio de lavado final de los ovocitos fueron sembrados directamente sobre una monocapa preformada de células MDBK y sometidas a cuatro pasajes en cultivo celular, de 72 hs de duración cada uno. La presencia del virus en los cultivos fue confirmada mediante inmunofluorescencia directa (IFD), empleándose un antisuero policlonal conjugado con fluoresceína. PCR: se realizo la prueba de PCR para vDVB en las muestras citadas según el protocolo descripto por Ridpath et al., 1994 (6). La secuencia de los primers utilizados para la amplificación de la PCR fueron 5´-CATGCCCATAGTAGGAC-3´; 5´-CCATGTGCCATGTACAG-3?. Resultados Se detectó la presencia del virus por IFD en células de la granulosa y en ovocitos. En el medio de lavado final y en los respectivos controles no se detectó la presencia del mismo. Los resultados obtenidos con la IFD fueron confirmados por una PCR, mediante la cual se detecto un fragmento de 283 bp característico de vDVB en células de la granulosa y en ovocitos. Discusión y Conclusiones Se ha reportado la presencia de antígeno viral en ovocitos provenientes de animales persistentemente infectados utilizando la técnica de IFD (7). En este estudio preliminar se observó que, no solo la células de la granulosa son susceptibles al vDVB, sino también que el virus sería capaz de atravesar la zona pelúcida e infectar ovocitos inmaduros. Aún queda por dilucidar que mecanismo/s permitiría/n la penetración del virus a través de la zona pelúcida. Referencias 1. Garoussi M.T, 2007. Veterinary Research Communications, 31: 365-370. 2. Gard, J.A., Givens, M.D., Stringfellow, D.A., 2007. Bovine viral diarrhea virus (BVDV): Epidemilogic concerns relative to semen and embryos. Therriogenlogy 68, 434-442. 3 Bielanski A, Algire J, Lalonde A, Nadin-Davis S, 2008. Transmisión of bovine viral diarrea virus ( BVDV) via in vitro-fertilized embryos to recipients, but not to their offspring. Theriogenology, article in press. 4. Bielanski A, Sapp T, Lutze-Wallace C, 1998. Association of bovine embryos produced by in vitro fertilization with a noncytopathic strain of bovine viral diarrhea virus type II. Theriogenology 49, 1231-1238. 5. Zurovac O, Stringfellow D.A, Brock K.V, Riddell M.G, Wright J.C, 1994. Noncytopathic bovine viral diarrhea virus in a system for in vitro production of bovine embryos. Theriogenology 41, 841-853. 6. Ridpath JF, Bolin SR, and Duvovi EJ, 1994. Segregation of bovine viral diarrhea virus into genotypes. Virology, 205:66-74. 7. Brownlie J, Booth P.J, Stevens D.A and Collins M, 1997. Expresión of non-cytopathogenic bovine viral diarrhoea virus ( BVDV) in oocytes and follicles of persistently infected cattle. Veterinary Record 141, 335-337. Title (in english): ISOLATION OF BOVINE VIRAL DIARRHEA VIRUS (BVDV) IN IN VITRO MATURED AND INFECTED BOVINE OOCYTES Keywords: Bovine viral diarrhea, in vitro production, oocytes.