Endonuclease Restriction patterns of Bovine Herpesvirus type 4 (BoHV4) isolates from Argentina

VERNA A; LEUNDA MR; MARIN MS; GONZALEZ ALTAMIRANDA E; PEREYRA S; PEREZ SE; ODEÓN AC

Congreso; World Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians-14th International Symposium, Madrid, Spain, 17-20 June 2009; 2009

INTRODUCCIÓN: Herpesvirus bovino tipo 4 (BoHV-4) es un gamaherpesvirus (familia Herpesviridae, género Rhadinovirus) [1] de distribución mundial. BoHV-4 se aisló tanto de ganado bovino aparentemente sano, así como de animales que exhiben una variedad de sintomatología clínica, incluyendo abortos, metritis, endometritis, vaginitis, enteritis e infecciones respiratorias. El rol patogénico del BoHV-4 aún no está esclarecido a pesar de su tropismo por las células del endometrio bovino [2] y se desconoce cuáles son las condiciones que se requieren para la expresión de enfermedad [4]. BoHV-4 ha sido recientemente aislado e identificado por PCR en Argentina [7], en asociación a problemas reproductivos del ganado bovino [8]. El presente trabajo describe la caracterización de los distintos aislamientos de campo de BoHV-4 de casos registrados en Argentina comparados con la cepa de referencia DN 559, utilizando PCR y enzimas de restricción. MATERIALES Y MÉTODOS: Se analizaron 12 muestras de mucus cérvico-vaginal (MCV) remitidas al Servicio de Diagnóstico Especializado de INTA Balcarce para el diagnóstico de enfermedades infecciosas de la reproducción (EIR), provenientes de establecimientos ganaderos de la provincia de Bs As. Cultivo celular y virus: Todas las muestras fueron propagadas en células MDBK (Madin Darby bovine Kidney), mantenidas en medio esencial Eagle conteniendo 10% suero fetal bovino, 100ug/ml de estreptomicina y 100U/ml de penicilina. La cepa de referencia DN559 de BoHV-4 fue utilizada como control. Extracción del DNA viral: El ADN fue extraído desde las células infectadas usando un KIT comercial (Quiagen). Reacción de PCR: El estudio de PCR para BoHV-4 fue llevado a cabo según (Egyed J, et al., 1986), con modificaciones. La secuencia de los primeros primers fueron 5´-GTTGGGCGTCCTGTATGGTAGC-3´; 5´-ATGTATGCCCAAAACTTATAATATGACCAG-3? el producto de amplificación fue de 576 bp. Los primers de la segunda ronda fueron; 5´-TTGATAGTGCGTTGTTGGGATGTGGT-3´ y 5´-CACT GCCCGGTGGGAAATAGCA-3´en esta ronda el producto amplificado fue de 260 bp. Los productos se observaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1.5 % teñidos con bromuro de etidio. Análisis con enzimas de restricción: El ADN viral fue digerido con endonucleasas de restricción, EcoR1, BamH1 y Hind III (Marca). El Phago Lambda DNA cortado con Hind III fue utilizado como Marcador de Peso Molecular. Los fragmentos fueron sujetos a electroforesis a 20V en geles al 0.8% de agarosa y visualizados con bromuro de etidio. RESULTADOS: En el año 2007 se aisló BoHV-4 a partir del MCV de dos casos de aborto en vacas de rodeo de cría, algunas de ellas con mastitis y en vaquillonas inseminadas artificialmente. Durante el año 2008 se registraron 10 nuevos casos, con las mismas manifestaciones clínicas. Si bien el diagnóstico de rutina para las EIR en estos casos resultó negativo, se observó un efecto citopático (ECP) compatible con herpesvirus en el cultivo de las muestras en células MDBK. La identificación preliminar de los de los dos primeros aislamientos se realizó con un anticuerpo monoclonal anti-BoHV-4, posteriormente todos los aislamientos fueron confirmados por un PCR nested modificado, obteniéndose un producto final de 260 bp, de acuerdo a lo esperado para el segmento amplificado.El patrón de restricción de los diferentes aislamientos con las enzimas EcoR1, Bamh1 y HindIII respectivamente mostró diferencias marcadas entre los aislamientos y la cepa de referencia DN559. El perfil de restricción del ADN BoHV-4 difirió completamente de otros tipos de herpes 1 y 5 DISCUSIÓN: La infección por el herpesvirus bovino tipo 4 (BoHV-4) está involucrada en los desordenes en el tracto reproductivo y su patogenicidad depende en cierta medida del tipo de cepa [6].La falta de reactivos económicos para un diagnóstico rápido y sensible limita las posibilidades de detección en forma rutinaria de las EIR, para las cuales la eficiencia del diagnóstico no supera el 45% [5]. Por otra parte, el diagnóstico molecular por PCR demostró ser una herramienta de gran valor en la identificación y caracterización de un virus emergente. Los resultados obtenidos demuestran diferencias importantes en el patrón de restricción entre las cepas analizadas y la cepa de referencia DN599, la cual representa al grupo de cepas americanas de BoHV-4; este análisis proporciona una visión de las variaciones en el genoma del virus, indicando que las cepas circulantes en el ganado bovino de Argentina podrían tener diversos orígenes. Aunque aún se desconoce la relevancia de BoHV-4 como agente primario en los trastornos reproductivos bovinos, resulta fundamental el desarrollo de técnicas de diagnóstico rápido y de identificación molecular para caracterizar a este virus. Se considera de relevancia estudios sobre la casuística de esta problemática a fin de conocer su posible impacto en la producción ganadera bovina. Este análisis preliminar de las cepas aporta información sobre la características genómicas de las cepas circulantes en el país. BIBLIOGRAFÍA 1-. Zimmerman W., Broll H., Ehlers B., Buhk H.-J., Rosenthal A., Goltz M. 2001. Genome sequence of bovine herpesvirus 4, a bovine Rhadinovirus, and identi.cation of an origin of DNA replication. Journal of Virology 75, 1186?1194. 2-. Donofrio G-, Herath S., Sartori C., Cavirani S., Filippo Flammini C., Sheldon L.M. 2007. Bovine herpesvirus 4 is tropic for bovine endometrial cells and modulates endocrine function. Reproduction 134, 183-197 3-. Egyed J., Ballagi-Pordany A., Bartha A., Belák S., 1996. Studies of in vivo distribution of bovine herpesvirus type 4 in the natural host. Journal of Clinical Microbiology 34, 1091?1095. 4-. Thiry E., Bublot M., Dubuisson J., Pastoret P.P. 1989. Bovine herpesvirus-4 (BHV-4) infection in cattle. In: W.G. (Ed.), Herpesvirus diseases of cattle, horses and pigs. Kluwer, Boston, MA, pp. 96?115. 5-. Campero C.M., Moore D.P., Odeón A.C., Cipolla A.L., Odriozola E. 2003. Aetiology of bovine abortion in Argentina. Vet. Res. Communications. 27:359-369. 6-. Castrucci G., Frigeri F., Ferrari M., Ranucci S., Aldrovandi V., Cilli V., Rampichini L., Gatti R. 1987. Experimental infection of calves with strains of bovine herpesvirus-4. Comp Immun Microbiol Infect Dis 10: 41-49. 7-. Verna AE, Leunda MR, Louge Uriarte EL, Lomónaco M, Pereyra SB, Odeón AC. 2008a. Primera evidencia virológica de Herpesvirus bovino tipo 4 (BoHV-4) en Argentina. Rev. Arg. Microbiol. 40(1):54-55. 8-. Verna AE, Leunda MR, Louge Uriarte EL, Pereyra SB, Marín MS, González Altamiranda E, Pérez SE, Odeón AC. 2008b. Herpesvirus bovino tipo 4 (BoHV-4), un nuevo agente asociado a problemas reproductivos del ganado bovino en Argentina. Proc. XVII Reunión Científico Técnica de la Asociación Argentina de Veterinarios de Laboratorios de Diagnóstico (AAVLD), V4.