JUGANDO A LA EVOLUCIÓN DE LA RESISTENCIA ANTIBIÓTICA: LA INTRODUCCIÓN DE LAS MUTACIONES Y69Q/V166E ACTIVAN A LA Β-LACTAMASA METAGENÓMICA DE CLASE A LRA-5

G. D'AMICO GONZÁLEZ ; M. M. RODRIGUEZ; B. GHIGLIONE; BRUNETTI, FLORENCIA; M. RUGGIERO; D. CENTRÓN; G. GUTKIND; P. POWER

Mar del Plata

Congreso; IV Congreso Argentino de Microbiología I Jornada de Microbiología general; 2018

Asociación Argentina de Microbiología

El análisis de metagenómica funcional en muestras de suelo de Alaska ha revelado la presencia de genes codificantes para las cuatro clases de β-lactamasas según Ambler, aún en ausencia de presión de selección antropogénica. Las serino-β-lactamasas (A, C, D) requieren de la presencia de un reducido número de residuos estrictamente conservados para una hidrólisis eficiente, y mediante mutaciones puntuales pueden adaptar su estructura para evolucionar hacia variantes más estables y/o activas. El objetivo principal de este estudio fue demostrar que sustituciones aminoacídicas en las posiciones 69 y 166 en la β-lactamasa metagenómica LRA-5 (previamente demostrada como una enzima con baja actividad hidrolítica) son suficientes para mejorar su actividad. Para ello, mediante mutagénesis dirigida por PCR se obtuvieron variantes mutacionales en el gen blaLRA-5 que codifican las sustituciones Y69Q, V166E y la doble mutación Y69Q/V166E. Los amplicones se clonaron en el vector de expresión pET28 y las construcciones transformadas en E. coli BL21. La expresión de las β-lactamasas se realizó por inducción con IPTG, y las enzimas fueron purificadas a homogeneidad por cromatografía de afinidad en sistema AKTA. Los principales parámetros cinéticos en el estado estacionario y de inhibición fueron obtenidos por espectrofotometría UV/Vis. Las variantes Y69Q y V166E no presentan actividad cinética frente a oxiimino-cefalosporinas, penicilinas e inhibidores de β-lactamasas. En cambio, la doble mutante Y69Q/V166E demostró una eficiencia hidrolítica (kcat/km) entre 2-27 veces mayor para las cefalosporinas ensayadas en relación a LRA-5 salvaje y las mutantes simples, aunque la actividad sobre ceftazidima fue casi 100 veces menor que para ceftriaxona. La actividad frente a penicilinas fue menor que para la variante salvaje, y aztreonam se comportó como un inhibidor competitivo. El clavulanato de litio inhibió eficientemente tanto la variante salvaje como la doble mutante. Estos resultados evidencian la importancia del resistoma ambiental como reservorio de genes de resistencia, y la importancia de determinados residuos aminoacídicos para la actividad de β- lactamasa. Nuestro estudio representa una ?imagen instantánea? de la ruta evolutiva de las β- lactamasas ambientales y su capacidad para evolucionar hacia variantes potencialmente más activas mediante la acumulación de un puñado de mutaciones eficientes.