Búsqueda de sustancias inhibitorias producidas por bacterias ácido lácticas aisladas de sangre de matadero aviar

ALTINA, MELISA G.; ASTESANA, DIEGO M.; BONANSEA EMANUEL F.

Santa Fe

Otro; XII Encuentro de jóvenes investigadores de la UNL y IV Encuentro de jóvenes investigadores de las universidades de Santa Fe; 2009

Universidades de Santa Fe

Las graves deficiencias en proteínas que afronta el sector agropecuario en varios países del mundo han sido y serán motivo de constante preocupación por parte de las autoridades con ingerencia en el tema. Dentro de este contexto, la sangre es una materia prima muy rica en proteínas de alto valor biológico. Los productos obtenidos a partir de la sangre están siendo aprovechados por una gran variedad de mercados. Los más utilizados son el plasma y la hemoglobina, concentrados proteícos que cuentan con propiedades gelificantes, emulsificantes, de absorción de agua y formación de espumas además de gran solubilidad. Por todas las importantes características mencionadas anteriormente ha sido necesario contar con mecanismos de conservación de la sangre frente a numerosos grupos bacterianos aerobios provenientes del estómago e intestino del animal faenado. Los procesos que se utilizan para preservar la sangre son variados, por ejemplo, el mantenimiento a temperaturas por debajo de los 4ºC, la bactofugación, la microfiltración y la alta presión hidrostática, entre otros. Otro mecanismo de conservación de la sangre es a través del uso de cultivos bioprotectores. Los mismos aprovechan la capacidad de la microbiota autóctona para inhibir o controlar el crecimiento y actividad potencial de microorganismos deteriorantes o patógenos. Las bacterias ácido lácticas (BAL) son las más utilizadas como cultivos bioprotectores. Este grupo está compuesto por Lactoctoccus, Lactobacillus, Enterococcus, Streptococcus, Leuconostoc y Pediococcus y generalmente producen ácido láctico como su principal producto final. La acción preservativa de las BAL es atribuida a la combinación de la acción de metabolitos antimicrobianos producidos durante el proceso fermentativo. Estos incluyen muchos ácidos orgánicos tales como el láctico, acético y propiónico que proveen un ambiente ácido desfavorable para el crecimiento de microorganismos patógenos y deteriorantes. Además de producir ácidos, las BAL producen otras sustancias inhibitorias tales como etanol producto de la vía heterofermentativa, H2O2 producido durante el crecimiento aeróbico y diacetilo que es generado por el exceso de piruvato proveniente del citrato. Algunas BAL tienen la propiedad de sintetizar sustancias antimicrobianas como parte de un mecanismo de defensa y de competencia ante otros microorganismos. Estas sustancias, conocidas como bacteriocinas, poseen una ventaja adicional, ya que durante el paso por el tracto digestivo son inactivadas por las proteasas presentes en el estómago, evitando así problemas de resistencia o inhibición de la microbiota normal del tracto gastrointestinal. Por lo tanto, la biopreservación con BAL es un método biotecnológico que promete tener un alto impacto en diferentes áreas de la industria alimentaria. La inoculación de BAL inmediatamente después de la recolección de la sangre en el matadero, permitiría obtener un producto menos contaminado, de mejor calidad y sin costos elevados. Por otra parte, la sangre siempre ha sido un problema grave para los mataderos ya que es uno de los residuos con mayor poder contaminante por su alta demanda biológica de oxígeno. Esto trae como consecuencia tratamientos muy costosos sin que ello elimine el efecto negativo sobre el medio ambiente. Por lo mencionado anteriormente, este trabajo se focaliza en la búsqueda de cepas productoras de sustancias inhibitorias, importantes en la bioconservación de la sangre aviar. Determinar la capacidad de las BAL aisladas de sangre de matadero aviar, para producir sustancias inhibitorias Para la búsqueda de cepas productoras de sustancias inhibitorias se utilizó el método de difusión en agar. Los microorganismos estudiados fueron BAL aisladas de sangre de matadero aviar pertenecientes al cepario del Laboratorio de Análisis de Alimentos del Departamento de Salud Pública Veterinaria (FCV-UNL). Para su utilización fueron reactivados en caldo MRS, mediante 3 pasajes sucesivos e incubados a 37ºC durante 24h. Para la búsqueda de sustancias inhibitorias se utilizaron los extractos libres de células (ELC) de las BAL. Los cultivos en caldo MRS (10 ml) incubados over night fueron centrifugados a 3500 rpm durante 15 minutos. Posteriormente, 1,5 ml de cada sobrenadante fueron transferidos a microtubos de 2 ml y centrifugados nuevamente a 10000 rpm durante 15 minutos para eliminar completamente cualquier resto celular. Seguidamente, 1,5 ml de cada sobrenadante fueron distribuidos en microtubos estériles, previamente rotulados como extracto libre de células sin neutralizar (ELC SN) y con la identificación de la cepa correspondiente. Los 8,5 ml restantes del sobrenadante inicial fueron transferidos a tubos de 20 ml. Posteriormente, se ajustó el pH entre 6 – 6,5 con NaOH 3M. Luego, 1,5 ml de cada sobrenadante fueron transferidos a microtubos de 2 ml para ser centrifugados a 10000 rpm durante 15 minutos. Se procedió de igual manera que para los ELC SN desde este paso rotulando cada microtubo como extracto libre de células neutralizado (ELC N) y con la identificación de cada cepa. De esta manera, fueron obtenidos 1,5 ml de ELC SN y 1,5 ml de ELC N por cada cepa, que fueron congelados a –80ºC. Para realizar el ensayo de difusión en agar se utilizaron 7 cepas tapiz (Escherichia coli, Salmonella spp., Pseudomonas fluorescens, Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum, Enterococcus faecium y Lactobacillus acidophilus) que fueron enfrentadas con los (ELC) obtenidos. Tanto el agar MRS (0,8%) como el agar BHI (0,8%), fueron fraccionados en porciones de 17 ml, esterilizados y mantenidos en baño a 45°C hasta el momento de su uso. Luego de incubar over night cada cepa tapiz en caldo BHI para las primeras 3 (cepas patógenas/alterantes) y en caldo MRS para el resto (BAL), se inoculó con 80 microlitros de cada cepa tapiz cada tubo con el agar correspondiente previamente acondicionado. Cada mezcla fue homogeneizada rápidamente en vortex y dispensada en placa de Petri estéril, previamente rotulada. Una vez que el medio agarizó, fueron realizados entre 10 y 11 hoyos hoyos de 5 mm de diámetro por cada placa, utilizando sacabocados estériles. Sobre la tapa de la placa se colocó la denominación de la cepa tapiz y sobre el fondo y en cada hoyo, el ELC a probar. Una vez preparadas las placas de Petri con las cepas tapiz, fueron colocados en cada hoyo 50 microlitros del ELC a analizar, trabajando siempre bajo gabinete estéril. Después de tapar y dejar reposar las placas unos minutos en heladera para permitir que los ELC difundieran en el medio agarizado, se llevaron a incubar a 37ºC durante 24 hs en aerobiosis. Finalizado el período de incubación, se observó presencia o ausencia de halos de inhibición de crecimiento del microorganismo tapiz. Además se comparó la presencia o ausencia de halos de inhibición para la misma cepa tapiz de cada ELC SN vs. ELC N. De las 62 cepas probadas, 45 fueron capaces de inhibir al menos otro microorganismo para los ELC SN enfrentados a las cepas tapiz. 13 microorganismos presentaron 2 halos de inhibición, 18 presentaron 3 halos, 3 presentaron 4 halos y solamente 2 cepas presentaron 5 halos. Las 9 bacterias restantes presentaron únicamente 1 halo de inhibición. Solamente 9 cepas presentaron halos de inhibición en las placas correspondientes a los ELC N y cada una de estas cepas inhibió solamente a una cepa tapiz. Además, estos 9 microorganismos que fueron positivos a la prueba para sus ELC N, lo fueron también para sus ELC SN Respecto a las cepas tapiz, L. casei y L. acidophilus no fueron inhibidas por ningún ELC. L. plantarum fue inhibido por 6 ELC SN y 4 ELC N. E. faecium presentó 27 halos de inhibición para los ELC SN pero solamente 3 para los ELC N. Tanto E. coli como Salmonella presentaron más de 30 halos de inhibición para los ELC SN pero ninguno para los ELC N correspondientes. La cepa tapiz patógena/alterante restante, P. fluorescens, fue inhibida por 14 ELC SN y por 2 ELC N. Se puede concluir que aproximadamente un 72% de las cepas testeadas, producen sustancias inhibitorias y que un 14% de éstas, generan el efecto mediante sustancias no relacionadas con los ácidos. Además, un 58% de los microorganismos productores de sustancias inhibitorias, inhiben a más de una cepa tapiz. Las BAL L. casei y L. acidophilus son las cepas tapiz más resistentes, dentro de las probadas, frente a sustancias inhibitorias producidas por las BAL estudiadas. L plantarum es más sensible a la sustancias inhibitorias no ácidas, contrariamente a lo que ocurre con E. faecium que es muy sensible a las ácidas. Las cepas tapiz patógenas son muy sensibles a las sustancias inhibitorias, pero solamente a aquellas que son ácidas.