EVALUACIÓN DE KITS COMERCIALES PARA LA EXTRACCIÓN DE DNA DE TRYPANOSOMA VIVAX EN RUMIANTES

FLORENTIN A.S; DUBOIS E.F; FIGUEREDO M,; MONZON C. M.

Buenos Aires

Congreso; VII Jornadas de Jóvenes investigadores; 2017

Facultad de Ciencias Veterinarias -UBA

Las enfermedades parasitarias causadas por hemoflagelados del género Trypanosoma producen importantes pérdidas económicas en áreas tropicales y subtropicales. T. vivax es originario de África y afecta bovinos, ovinos, caprinos, búfalos y cérvidos salvajes, ubicándose principalmente en sangre, linfa y ganglios linfáticos. En Argentina, fue hallado en el año 2008 en bovinos y búfalos de Formosa y Chaco mediante métodos parasitológicos. La técnica de PCR, ha permitido revelar infecciones en animales sintomáticos o asintomáticos sin parasitemia detectable, con gran sensibilidad y especificidad. El objetivo del presente trabajo fue evaluar dos kits comerciales para la extracción de DNA de T. vivax en rumiantes de la provincia de Formosa y comparar los resultados por PCR. Se recolectaron muestras de sangre de 19 rumiantes de 3 establecimientos diferentes. Se realizó determinación del hematocrito, la prueba de Woo y frotis coloreado con Giemsa para la observación directa del parásito. Se seleccionaron dos kits comerciales para la extracción de DNA, ?Kit 1: Inbio Highway? y ?Kit 2: Roche?, y se aplicaron según sus indicaciones. Al kit 1, se le realizó un ensayo posterior para evaluar el protocolo descripto versus el reemplazo de SILE por PBS, la utilización de doble cantidad de sangre y el uso del sobrenadante que se descarta. Se realizó la PCR dirigida al gen PRAC (Proline Racemase) de T. vivax. Los productos obtenidos fueron analizados en gel de agarosa al 2% con Bromuro de Etidio. Los resultados mostraron un hematocrito promedio de 22% con valor mínimo de 9% y máximo de 33%. Del total de muestras, 8 resultaron positivas a T. vivax mediante observación directa. La PCR PRAC detectó 6 de las 8 muestras positivas con kit 1, y 8 positivas con el kit 2, de las cuales, una no pudo ser detectada a la observación directa. El ensayo realizado al kit 1, presentó como resultado la presencia de DNA parasitario en todos los tratamientos, inclusive en el descarte. La especificidad de la PCR fue evaluada con DNA heterólogo de Babesia bovis, B. Bigemina, Anaplasma marginale y T. evansi, resultando todas estas muestras negativas. Discusión: En el presente trabajo, el kit 2 detectó 2 animales positivos más que el kit 1. La principal diferencia entre estos kits, es el descarte de sobrenadante en el kit 1. Debido a la pérdida de DNA en el mencionado descarte, se podría explicar la diferencia en los resultados de la PCR. La PCR funcionó adecuadamente utilizando el protocolo reportado, lo que demuestra la conservación de las regiones blanco de los primers utilizados (PRAC fue ajustada con cepas de Etiopía, Nigeria y Venezuela) y la especificidad resultó elevada. Podemos concluir que consideramos al kit 2 más adecuado para la extracción de DNA de T. vivax y, teniendo en cuenta que el diagnóstico parasitológico es el único método de diagnóstico implementado en Argentina (sensibilidad del 68%), es menester ajustar con un mayor número de muestras, pruebas moleculares que podrían resultar con elevada sensibilidad y especificidad.