Análisis estructural de la interacción entre el dominio de anclaje y dimerización de la Proteína Quinasa A de Saccharomyces cerevisiae y potenciales péptidos interactores

GONZALEZ BARDECI, NICOLÁS; GALELLO, FIORELLA; TURJANSKI, ADRIÁN; ROSSI, SILVIA

Workshop; 1er Workshop Argentino de Biofísicoquímica de Proteínas; 2011

La regulación espacial y temporal de la señalización por la proteína quinasa dependiente de cAMP (PKA) está dada por su localización subcelular, que es mediada por proteínas de andamiaje denominadas AKAPs (A Kinase Anchoring Proteins) La holoenzima tetramérica es catalíticamente inactiva, y en mamíferos consta de un dímero de subunidades regulatorias (R) y dos subunidades catalíticas (C) La región de interacción entre las dos R comprende los primeros 45 aminoácidos de su extremo amino terminal, y constituye el dominio de anclaje y dimerización (D/D) cuya estructura corresponde a un arreglo antiparalelo de cuatro hélices. Existen cuatro isoformas de R que difieren en secuencia pero que presentan en el dímero un núcleo de interacciones bien conservado. Se han identificado además numerosas AKAPs; todas ellas presentan una pequeña hélice anfipática que interactúa con el dominio D/D de R, formando los complejos de anclaje. Las estructuras que se han resuelto para este dominio, tanto en su forma apo como en presencia de distintos péptidos interactores, permitieron establecer los determinantes estructurales que dominan dicha interacción. Sin embargo, hasta la fecha se ha reportado solamente una AKAP en otros organismos (C. elegans) Se han determinado los residuos que dominan la interacción entre esta proteína y su correspondiente subunidad R, y se ha observado que no se cumplen con las características conocidas para los complejos de mamíferos. Recientemente hemos identificado varias proteínas ?candidatas? a AKAPs en la levadura Saccharomyces cerevisiae, y hemos demostrado su interacción con la subunidad R de la PKA de dicho organismo (Bcy1) mediante arreglos de péptidos. Por otro lado, hemos llevado a cabo mediante esta técnica un análisis mutacional que ha permitido definir los residuos importantes para la interacción entre péptidos correspondientes a estas proteínas y Bcy1. El objetivo de este trabajo es avanzar en el entendimiento de la estructura del dominio D/D de Bcy1 y definir los determinantes estructurales que caracterizan su interacción con las putativas AKAPs de S. cerevisiae. Para ello se realizó un análisis bioinformático de Bcy1 y de sus péptidos interactores, junto con experimentos de entrecruzamiento químico para conocer el estado oligomérico de Bcy1 en solución. Se construyeron modelos por homología del extremo amino terminal de Bcy1 en su forma apo y en distintos complejos. Los resultados de los arreglos de péptidos fueron analizados a la luz de estos modelos. El análisis bioinformático muestra que Bcy1 presenta los residuos que han sido reportados como indispensables para la dimerización. Los experimentos de entrecruzamiento químico muestran la existencia de un dímero en solución y permiten concluir que la región de dimerización está presente dentro de los primeros 85 aminoácidos. El análisis de los modelos permitió obtener información estructural preliminar de la interacción entre Bcy1 y los péptidos. Dicha interacción muestra características únicas, que la distinguen de la interacción conocida en mamíferos, corroborando los resultados de los arreglos de péptidos.