Herramienta molecular para la identificación de las especies de dermatofitos con mayor prevalencia en Argentina

DUDIUK, CATIANA; GOMEZ, V; BARBAGELATA, MARÍA SOL; GARCIA, G.

Buenos Aires

Congreso; Congreso Argentino de Microbiología ? Jornada SADEBAC. Noviembre 2018, Buenos Aires.; 2018

La dermatofitosis es la patología dermatológica de origen fúngico más común. Es una enfermedad transmisible y de difícil curación. En la mayoría de los laboratorios el diagnóstico implica el uso de técnicas convencionales, como el examen directo y el cultivo. Sin embargo, la microscopia directa carece de especificidad y de sensibilidad, y se obtienen resultados falsos negativos. Por otra parte la identificación de especies a través del cultivo requiere de personal experimentado y demanda hasta 4 semanas de espera. Otro problema adicional es la alta tasa de contaminación que presentan los cultivos y la baja recuperación. Estos inconvenientes evidencian la necesidad de desarrollar técnicas moleculares basadas en características genotípicas más específicas y que tienden a estar menos afectadas por condiciones externas.Objetivo: Diseño de una herramienta molecular basada en PCR multiplex para la rápida identificación de Trichophyton rubrum, T. mentagrophytes, T. tonsurans, Epidermophyton floccosum, Microsporum canis, M. gypseum y de dermatofitos en general.Materiales y Métodos: se utilizaron 6 cepas control de dermatofitos, para poner a punto la técnica evaluada. Además, se utilizaron 34 cepas provenientes de aislamientos clínicos para evaluar la especificidad del método. Todas las cepas fueron identificadas fenotípicamente y mediante secuenciación de sus operones ribosomales (rDNA-ITS) que es el método considerado como gold-standard. Para la generación de la herramienta molecular, se realizó una búsqueda de las secuencias nucleotídicas de la región ITS1-5.8s-ITS2 del rDNA de las especies T. rubrum, T. mentagrophytes, T. tonsurans, E. floccosum, M. canis, M. gypseum y de otros dermatofitos menos prevalentes. Esta región se caracteriza por presentar zonas muy conservadas (genes ribosomales), y regiones muy variables con alta susceptibilidad a acumular mutaciones (ITS1 e ITS2). Basándonos en estas características, se diseñaron cinco oligonucleótidos. Uno de ellos se diseño de acuerdo a las regiones específicas y conservadas dentro de la región ITS1 del género Trichophyton, mientras que los cuatro restantes, fueron diseñados teniendo en cuenta las discrepancias observadas en las secuencias nucleotídicas de la región ITS2 pertenecientes a las distintas especies de dermatofitos . A estos oligonucleótidos se les acoplaron primers publicados previamente. Estos primers se distribuyeron en 3 tubos, conformando un set de PCR multiplex que permite mediante las diferencias de tamaño de los productos de amplificación, la identificación de los dermatofitos con mayor prevalencia en Argentina.Resultados: Los resultados de identificación obtenidos con el set de PCR multiplex desarrollado, presentaron una total concordancia con los resultados obtenidos por secuenciación del rDNA (100% de especificidad).Conclusión: Estos resultados nos permiten concluir que esta técnica permite identificar inequívocamente (100% correlación con método gold standard) y en 4 hs a nivel de género y especie, los dermatofitos con mayor prevalencia en nuestro país.