Expresión de la actividad proteolítica de Paecilomyces lilacinus sobre un sustrato queratínico

CAVELLO, I.; GORTARI, M.C.; GALARZA, B.; CAVALITTO, S.; HOURS, R.A.

Coronel Suárez, Prov. de Bs. As.

Jornada; III Jornadas de Microbiología Clínica, Industrial y Ambiental de la Provincia de Buenos Aires; 2009

Departamento de Microbiología, Carrera de Microbiología Clínica e Industrial, Facultad de Ciencias Veterinarias, UNLP.

Expresión de la actividad proteolítica de Paecilomyces lilacinus sobre un sustrato queratínico Cavello I1,2, Gortari MC1,3, Galarza B3,4, Cavalitto S1,2, Hours R1,2 (1CINDEFI- 2CONICET-3CIC-4CITEC)   Como resultado del estudio de la actividad antagónica sobre huevos de nematodos, se ha detectado en Paecilomyces lilacinus (Thom) Samson LPSC # 876, actividad enzimática proteolítica y quitinolítica. En función de estos hallazgos, se lo utilizó en el presente trabajo para analizar la expresión de enzimas proteolíticas en cultivos líquidos y sólidos al crecer sobre otros sustratos proteicos complejos como el “residuo pelo vacuno” (proveniente de un depilado conservador del pelo en Tecnología del Cuero) como única fuente de C y N. Materiales y métodos: Paecilomyces lilacinus se cultivó sobre “residuo pelo”, lavado y esterilizado, al 1% en el caso de cultivo líquido (batch) en agitación y en medio sólido, con 5 g en placa de Petri. Los medios fueron inoculados con 105 ufc/ml. Se incubaron a 28ºC, y se extrajeron muestras diariamente, con ClNa 0,5N en el caso del medio sólido. En el medio líquido se midió su pH y posteriormente se centrifugó. Los extractos provenientes de lo dos medios fueron filtrados con membrana de 45 μm antes de ser analizados. La concentración proteica se determinó por el método de Bradford (µg/ml). Para la medida de la actividad azocaseinolítica se tomaron 0,10 ml de extracto crudo y se le adicionaron 0,25 ml de azocaseína al 1% (p/v) en buffer Tris-HCl 0,1 M, pH 9. La mezcla fue incubada a 37ºC en baño termostático durante 30 min. La reacción se detuvo por el agregado de 1 ml de TCA al 10% y posterior centrifugación. Finalmente se midió el desarrollo de color a λ = 440 nm mediante el agregado de 1 ml de NaOH a 1 ml del sobrenadante. Se definió la unidad de actividad como la cantidad de enzima que producía un incremento de 0,1 unidades de A440nm por min y por ml en las condiciones del ensayo. Los resultados muestran que la actividad azocaseinolítica es similar en ambos medios en el 4º día de cultivo, descendiendo abruptamente para el medio líquido a partir de ese día. En el medio sólido la actividad se mantiene en un rango constante y desciende a partir del día 21. La actividad específica fue superior en el medio sólido que en el líquido en todas las muestras.Conclusión: En el presente trabajo se pudo demostrar que Paecilomyces lilacinus genera un extracto enzimático con alta actividad proteolítica, al crecer sobre una proteína natural de alta resistencia a su degradación como es la queratina del “residuo pelo” vacuno. Asimismo se demostró que en el medio sólido se genera un pool enzimático con una mayor actividad proteolítica específica que en el medio líquido, lo que llevaría a elegir ese medio para estudios posteriores de caracterización y purificación, por su alto rendimiento.