La producción de xilanasas por Pseudobutyrivibrio xylanivorans confirma el potencial fibrolítico de este futuro probiótico.

S. RUIZ; M.C. GIMENEZ; G.N. ARENAS; N. SOHAEFER; L. PEREYRA; C. PEREYRA; A. GAIA; C. GONCALVES; SECHOVCOVÁ H; J.MRAZEJ; D. GRILLI

Jornada; X Jornadas de Investigación de la Universidad Juan A. Maza; 2018

Recientemente, nuestro equipo logró aislar una bacteria de la especie Pseudobutyrivibrioxylanivorans (cepa 2) a partir del contenido ruminal de cabras Criollas. En esta cepa, seidentificaron los genes que codifican para xilanasas involucradas en la degradación de la fibravegetal. La caracterización de las enzimas fibrolíticas producidas por P. xylanivorans 2,mediante enzimogramas y la determinación de su actividad enzimática, confirmarían elpotencial fibrolítico de esta cepa para ser utilizada como probiótico. Para confirmar estosresultados se compararon los resultados obtenidos con la cepa de referencia (P. xylanivoransMz5). Por lo tanto, ambas cepas se cultivaron anaeróbicamente a 38 °C en un medio líquidosin fluido ruminal que contenía 0,5% de xilano o 0,2% de glucosa. Las bacterias secosecharon después de un crecimiento de 5 días, mediante centrifugación a 3000 rpm y selavaron con buffer fosfato de sodio (50 mM, pH = 6,5). El sobrenadante se filtró a 10 °Cutilizando una membrana Millipore y se almacenó inmediatamente a -20ºC. El pelletbacteriano (o fracción celular) se conservó en esta misma temperatura. La actividad xilanasade ambas cepas se determinó espectrofotométricamente en las fracciones celulares(endoxilanasas) y sobrenadantes (exoxilanasas), utilizando 0,5 % de xilano en buffer fosfatode sodio a 37 °C. Las concentraciones de azúcares reductores se determinaron después de laincubación de las muestras con el sustrato, a 37 °C durante 150 minutos, de acuerdo con elmétodo descripto por Lever. Mediante electroforesis en gel de poliacrilamida utilizando SDS(SDS-PAGE) y detección visual de la actividad xilanolítica, se realizó el análisis funcional de lacapacidad de degradación del xilano por ambas cepas. Para ello, después de lacentrifugación de los cultivos, las proteínas celulares y las proteínas sobrenadantes sesepararon mediante SDS-PAGE. Las muestras se incubaron durante 10 min a 80 °C antes deejecutar el gel. El procedimiento para realizar los xilanogramas fue el mismo utilizado pararealizar SDS-PAGE convencional, adicionando un 0,5% de xilano al gel separador. Despuésde la electroforesis, las enzimas se renaturalizaron en buffer Tris HCl 50 mM (pH = 6,8) ymercaptoetanol 5 mM con EDTA 1 mM. Las proteínas con actividad xilanolítica se detectaroncomo zonas ?aclaradas? después de la re-naturalización, incubación y tinción del gel consolución alcalina de rojo Congo (Sigma). Los pesos moleculares de las enzimas sedeterminaron con marcadores de proteínas (BioLabs, New England). Los resultados muestranen ambas cepas una endoxilanasa constitutiva de 45 kDa, cuya actividad xilanolíticaespecífica fue 50 ug/mL/h, duplicada (100 ug/mL/h) luego de la inducción generada por lapresencia de xilano. Se identificaron exoxilanasas de 45 a 58 kDa en ambas cepas que fueroninducidas por la presencia de xilano. A partir de estos resultados se puede concluir que P.xylanivorans 2 expresa su actividad xilanolítica máxima en presencia de xilano y confirma elpotencial fibrolítico de este futuro probiótico.