PRODUCCION DE LACASA FÚNGICA EN FERMENTACIONES EN ESTADO SÓLIDO UTILIZANDO PRODUCTOS DERIVADOS DE SOJA

MARÍA PAULA MORELLI; BEATRIZ FARRUGGIA ; DARÍO SPELZINI

Casilda

Congreso; XIV Congreso y XXXII Reunión Anual de la Sociedad de Biología de Rosario; 2012

Sociedad de Biología de Rosario

Las actividades de las industrias papeleras y agrícolas producen un impacto ambiental. Uno de los compuestos más nocivos son los hidrocarburos aromáticos policíclicos. En los últimos tiempos se han comenzado a emplear microorganismos que produzcan enzimas para la degradación de estos compuestos. Entre las especies de hongos que tienen esta capacidad se encuentran los basidomicetos Trametes versicolor que producen lacasa como parte de su sistema lignolítico. Esta enzima extracelular oxida compuestos policíclicos. Una de las limitaciones para la producción de enzimas en escala industrial es el elevado costo de las materias primas necesarias. Una alternativa ante esta problemáticas es la producción a nivel industrial de enzimas fúngicas en fermentaciones de estado sólido utilizando medios de cultivos conformados por materiales considerados como desecho. Estos sustratos proveen algunos de los nutrientes necesarios para el desarrollo de los cultivos, de esta forma se reducen los costos de producción y se reutilizan compuestos considerados subproductos de otras industrias. Las fermentaciones de estado sólido permiten que los microorganismos crezcan en ausencia de agua libre. El objetivo de este trabajo fue producir lacasa extracelular por fermentación en estado sólido de T. versicolor utilizando como sustrato derivados de la industrialización de la soja. Para el tratamiento de sustrato, los residuos de soja fueron provistos por Molinos Río de la Plata S.A. clasificados como sustrato cáscara de soja (CS) y sustrato pellet de soja (PS). El PS debido a la heterogeneidad de tamaño fue separado usando distintas mallas de tamiz, obteniéndose partículas grandes (PSG) mayor a 840 m, partículas pequeñas (PSP) menor a 840 m. La CS tuvo un tamaño mayor a 840 m. A cada fracción de sustrato se les midió el índice de ganancia de agua (IGA) para determinar la cantidad de medio líquido que puede contener cada sustrato, agregando 5 mL de agua a 1 g de sustrato, luego se centrifugó la mezcla, se descartó el agua y se midió el peso del sustrato húmedo. Los pellets de soja utilizados como sustrato en las fermentaciones de estado sólido presentan gran heterogeneidad de tamaño y composición, figura 1. El CS está compuesto de hojuelas. El PSG presenta fragmentos partidos de granos y material leñoso. El PSP es una harina más homogénea en distribución de tamaño. Esta heterogeneidad en tamaño, forma y composición se refleja en los distintos índices de ganancia de agua que se obtuvieron y se muestran en la Tabla 1. La fermentación en estado sólido fue llevada a cabo utilizando una cepa de T. versicolor adquirida en el Instituto Spegazzini. Se mantuvieron en picos de flauta de agar-papa a 4°C. Se repicaron en placas de petri de agar-papa y crecieron a 26°C durante 5 días. Se inoculó 1 disco de 1,2 cm de diámetro de agar-papa con micelio en placas conteniendo 3 gramos de sustrato de soja y medio líquido según la cantidad calculada de acuerdo al índice de ganancia de agua determinado para cada sustrato. El medio líquido tuvo la siguiente composición por litro: glucosa, 15 g; NaNO3, 2,5 g; Mg2SO4, 0,5 g; KH2PO4, 0,5 g; K2HPO4, 0,6 g; CuSO4, 0,4 g; y cantidades traza de MnCl2; H3BO3; Na2MoO4; FeCl3 y ZnCl2. Los sustratos y el medio líquido fueron autoclavados a 121°C durante 15 minutos. La fermentación fue llevada a cabo a 30 °C y se determinó el crecimiento de la biomasa midiendo el crecimiento radial de micelio en las cajas de petri, los datos se informaron como diámetro del halo de crecimiento en centímetros en función del tiempo. Se tomaron muestras de cultivos a distinto tiempo para determinar la actividad lacasa extracelular. La figura 1y 2 muestran el crecimiento de los cultivos en los distintos sustratos, el crecimiento fue mayor en el caso de CS, cubriendo toda la placa a los 8 días, seguido por el PSP. En el caso de PSG el crecimiento se detuvo a los 5 días a un diámetro de 2,23 cm. La extracción y determinación de la lacasa extracelular fue realizada en los tiempos seleccionados se mezcló el sustrato de las placas con una cantidad adecuada de buffer acetato 25 mM a pH 4,5 y se agito el sistema durante 10 minutos, a estos extractos se determinó la actividad lacasa con ácido 2,2?-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfónico) La figura 2 muestra la actividad de lacasa extracelular determinada a distintos tiempos de fermentación en los distintos sustratos. La producción a los 6 días fue máxima en PSG, 348 U/L; seguido de PSP, 270 U/L y CS 97 U/L. Esto va en orden opuesto a lo observado en el crecimiento de la biomasa sobre esos sustratos. Este hecho puede explicarse considerando que los hongos como T. versicolor producen enzimas del sistema lignolítico, como la lacasa, cuando no tienen acceso a fuentes de carbohidratos fácilmente asimilables como la glucosa. Como el crecimiento sobre PSG es lento, la glucosa adicionada se agota localmente, por lo tanto el microorganismo accede a las fuentes de carbono presentes en los sustratos produciendo lacasa que degrade la lignina. A los 9 días, la producción de lacasa aumentó, 787 U/L para PSP y 536 para CS, probablemente debido a que la glucosa adicionada en el medio líquido se agotó. Los sustratos utilizados son aptos para la producción de enzimas fúngicas.