Estudio in vitro de 14 mutaciones de la CBS encontradas en pacientes homocistinúricos

C ASTEGGIANO, R URREIZTI , M COZAR, MA VILASECA, D GRINBERG, S BALCELLS

Palma de Mallorca, 5 al 7 de Octubre 2005, España.

Congreso; AECOM 6to Congreso Nacional de Errores Congénitos del Metabolismo; 2005

AECOM (Asociación de Errores Congénitos del Metabolismo)

   La homocistinuria clásica, es una enfermedad autosómica recesiva debida a la deficiencia de la enzima Cistationina b-Sintasa. Está caracterizada por altos niveles de homocisteína y metionina en plasma y orina. En el gen CBS, localizado en el cromosoma 21q22.3, han sido descritas más de 130 mutaciones. El objetivo del presente trabajo, fue analizar la expresión proteica y la actividad enzimática, de 14 mutaciones de la CBS encontradas en nuestros pacientes. El cDNA del gen CBS se clonó en un vector plasmídico pkk3.88 y por mutagénesis dirigida generados los 14 alelos mutados que fueron secuenciados. Las proteínas fueron expresadas en la cepa XL-Blue de E.coli, y medidas las actividades enzimáticas in-vitro. Para analizar el nivel de expresión, se realizaron geles de acrilamida SDS-PAGE, y geles nativos no-desnaturalizantes. Las 14 mutaciones caracterizadas fueron: R125W, G148R, M173V, T191M, A226T, C275Y, R336C, R336H, L338P, S349N, R379Q, L456P, G522fsX540 y R548Q. El 80% de las mutaciones (11 mutaciones), evidenciaron una actividad enzimática menor al 5% respecto a la nativa. Las mutaciones A226T y M173V, presentaron una actividad enzimática cercana al 20% respeto a la proteína nativa, y la mutación R548Q superior al 68%. El mismo cambio (R548Q) fue encontrado en un cromosoma control, sugiriendo que podría deberse a un nuevo polimorfismo, más que a una mutación patogénica. El nivel de expresión de las proteínas mutadas, estuvo disminuido respecto a la proteína nativa. La capacidad tetramérica se observó en la proteína nativa, en dos mutaciones estuvo dramáticamente reducida y completamente ausente en el resto de ellas.