Seroprevalencia de neosporosis en pequeños rumiantes mediante IFI y ELISA de competición basado en la proteína recombinante tSAG1

M. B. NOVOA; N. AGUIRRE,; N. ORMAECHEA; S. PALERO; V. ORCELLET; B VALENTINI,; M. SARLI; M E. PRIMO,; V. VANZINI; I. ECHAIDE.

Río Cuarto

Congreso; XXII Reuníon Científico Tecnica de la Asociación Argentina de Veterinarios de laboratorios de diagnóstico; 2018

Asociación Argentina de Veterinarios de Laboratorio de Diagnóstico

IntroducciónLa neosporosis, causada por el parásito intracelular obligado Neospora caninum, es una enfermedad global que afecta diferentes especies de animales domésticos y silvestres, entre ellos bovinos y pequeños rumiantes. La inoculación experimental de N. caninum a ovinos y caprinos genera abortos y transmisión transplacentaria1. También se reportó a la neosporosis como causante de fallas reproductivas en una majada ovina2. En trabajos realizados en la pampa humeda en Argentina3 y en el estado de San Pablo en Brasil4 se reportaron prevalencias de neosporosis del 3% y del 9% respectivamente.El objetivo de este trabajo fue establecer la prevalencia de neosporosis en caprinos y ovinos de las provincias de Entre Ríos y Santa Fe, utilizando inmunofluorescencia Indirecta (IFI) y un ELISA de competición (cELISA) basado en la proteína de superficie SAG1 de N. caninum.Materiales y MétodosSe analizaron 1901 muestras de suero de 1483 cabras y 418 ovejas de 201 majadas de las provincias de Entre Ríos y Santa Fe (Tabla 1).Los sueros se analizaron mediante inmunofluorescencia indirecta (IFI) en dilución 1:505. La prueba de cELISA se basó en la proteína recombinante truncada (tSAG1) expresada en Escherichia coli y el anticuerpo monoclonal (AcM) P1C2D8F8 que la reconoce específicamente. Brevemente, se expresó en E. coli la proteína de superficie SAG1 truncada (sin péptido señal y porción transmembrana c-terminal). Se tapizaron placas de 96 pocillos con 50 µl de tSAG1 (1 µg/µl) diluido en PBS y se incubaron ON a 4ºC. Luego de dos lavados con PBS, las placas se bloquearon con buffer de bloqueo (PBS + 10% de leche descremada). Las placas se lavaron 3 veces con buffer de lavado (PBS + 0,05% de tween20) y se agregaron 100µl de los sueros para diagnóstico y los controles, diluidos 1:2. La placa se lavó 3 veces con buffer de lavado y se incubó con el AcM diluido 1:2000. Se repitieron los lavados y se agregó el anticuerpo anti IgG1 de ratón conjugado con peroxidasa diluido 1:4000. La reacción se reveló con ABTs/H2O2 y la DO405nm se midió a los 10 minutos. Todas las incubaciones se realizaron durante 40 minutos a 25ºC y los sueros y reactivos se diluyeron en buffer de lavado con 10% de leche descremada. Los resultados se expresaron en porcentaje de inhibición (I%), tomando como referencia la densidad óptica que genera la reacción entre el AcM y su epitope específico, sin interferencia de suero según la siguiente formula: I% = 100-[(ODmuestrax100)/ODAcM+tSAG1].Se determinó el punto de corte, la sensibilidad (Se) y especificidad (Es) de cELISAtSAG1 respecto de IFI mediante el análisis de la curva de características operantes de un receptor (ROC). La concordancia entre cELISA e IFI se evaluó mediante el valor kappa (k) usando el programa MedCalc. ResultadosEl cELISAtSAG1 demostró una Se de 94,5% y una Es de 94,3% con un punto de corte de 30%I (Figura 1). La concordancia entre cELISAtSAG1 e IFI fue 94,4% con un k = 0,789.Se detectaron anticuerpos contra N. caninum en ovinos y caprinos de la región analizada. En ambas provincias, más del 45% de las majadas tuvo al menos un animal seropositivo. En animales la prevalencia de neosporosis fue similar en ambas especies y provincias siendo en todos los casos superior al 10% (Tabla 1).Discusión y conclusionesLos resultados evidencian la presencia de neosporosis en ovinos y caprinos de las provincias de Entre Ríos y Santa Fe. La prevalencia encontrada fue superior a la reportada en la pampa húmeda, y similar a la reportada en Brasil.La eficiencia del cELISAtSAG1 y su concordancia con IFI, indican que podría utilizarse para estudios de seroprevalencia de neosporosis en pequeños rumiantes, porque admite una interpretación objetiva de los resultados, es automatizable y permite procesar gran número de muestras diarias. El uso de antígenos recombinantes favorecería la estandarización de la técnica y la transferencia de la misma. Se deberá establecer la asoiación entre la seroprevalencia observada y la ocurrencia de casos clínicos (abortos) mediante pruebas directas (PCR, IHQ, aislamiento), para conocer el efecto de la neosporosis sobre la eficiencia reproductiva en pequeños rumiantes.Bibliografía1. Buxton D, et al. Immunity to experimental neosporosis in pregnant sheep. Parasite Immunol. 2001;23(2):85-91. 2. González-Warleta M, et al. Neospora caninum infection as a cause of reproductive failure in a sheep flock. Veterinary Research 2014;45-88.3. Hecker Y, et al. First report of seroprevalence of Toxoplasma gondii and Neospora caninum in dairy sheep from Humid Pampa. Trop Anim Health Prod. 2013;45:1645-16474. Figliuolo LPC, et al. Prevalence of anti-Toxoplasma gondii andanti-Neospora caninum antibodies in ovine from São Paulo State, Brazil. Vet. Parasitol. 2004;123:161-166 5. Jolley WR, et al. Repetitive abortion in Neospora caninum infected ewes. Vet. Parasitol. 1999; 82:251-257