Descontaminación de boro en suelo por Sreptomyces a través de Exopolisacáridos

MORAGA, N. B; AMOROSO, M.J; RAJAL, V.B

Santa Fe

Simposio; 3º Simposio Argentino de Procesos Biotecnológicos; 2014

Universidad Nacional del Litoral

Introducción:Los polisacáridos son polímeros de carbohidratos cuya diversidad estructural refleja las diferentes funciones que tienen. Existen dos tipos de polisacáridos, los de reserva (como el glucógeno) y los estructurales (como la celulosa). Los exopolisacáridos (EPS) pertenecen a este último grupo. Pueden ser producidos por algas, plantas, animales y bacterias y son los responsables de las interacciones entre células y también con superficies sólidas. Los EPS pueden tener diferente composición aún cuando sean generados por una misma especie, ya que la composición también varía con las condiciones ambientales donde ellos se producen. Esto incluye disponibilidad de oxígeno y de nutrientes, temperatura, pH y presencia de factores estresantes tales como metales pesados y elevadas concentraciones de sales, entre otros. Diferentes estrategias empleando microorganismos se han desarrollado para descontaminar ambientes naturales debido a las ventajas ecológicas y económicas que representan. La importancia de los EPS generados por bacterias radica en su potencial aplicación en la remediación de ambientes contaminados por la minería o los procesos industriales. En cuanto al empleo de los EPS en la remoción de metales pesados, su uso se fundamenta en la posibilidad que tienen estas matrices poliméricas de unir o complejar los metales presentes en la solución y flocularlos. Existen estudios concluyentes acerca de bacterias que generan EPS como mecanismo de defensa ante diversos estresores en múltiples microorganismos, incluídas las actinobacterias. En el presente trabajo se utilizaron dos cepas previamente aisladas de suelos contaminados con boro de la provincia de Salta y caracterizadas genéticamente, Streptomyces sp. 002 y 048. Los objetivos de este trabajo fueron cultivar las bacterias seleccionadas en medio líquido con y sin ácido bórico y evaluar el efecto de la presencia del boro sobre la producción de biomasa y de EPS, a la vez que analizar su destino.Metodología:Se estudió el crecimiento de las cepas seleccionadas en dos medios líquidos, Medio Mínimo (MM) y Extracto de Suelo (ES) con y sin el agregado de ácido bórico (H3BO3) hasta alcanzar concentraciones finales de 20 y 40 mM. Se utilizaron inóculos frescos para la siembra, que se prepararon a partir de suspensiones de esporos (4x106 UFC/mL) cultivadas en MM, sin agregado de ácido bórico, por 12 h, a 30 ºC y 250 rpm. En todos los casos, se inocularon 650 μL de los correspondientes cultivos en Erlenmeyers de 100 mL conteniendo 20 mL de medio líquido con y sin el agregado de soluciones de ácido bórico. Estos últimos se usaron como control del crecimiento. Se incubaron 5 días a 30 ºC y 250 rpm en incubadoras con agitación orbital, con el fin de evaluar el crecimiento en presencia de ácido bórico. La composición del MM, en g/L, fue: glucosa, 10,0; L-asparagina, 0,5; K2HPO4, 0,5; MgSO4.7H2O, 0,20; FeSO4.7H2O, 0,01, pH 7,0 ± 0,5. El medio ES se preparó resuspendiendo 300 g de suelo, tomados de entre 0 y 15 cm de profundidad, en 600 mL de agua corriente y calentando a ebullición por 1 h con agitación constante. Luego de 24 h se centrifugó durante 15 min a 11.700 rpm, se filtró y se llevó a pH 7,0. El ácido bórico se agregó a los medios estériles distribuidos en los Erlenmeyer hasta alcanzar las concentraciones de 20 mM (pH 5,60) y 40 mM (pH 5,46). Las muestras se tomaron a diferentes tiempos, retirando de las incubadoras un set de Erlenmeyers de cada medio: sin ácido bórico y con las dos diferentes concentraciones. Para cada muestra se recuperó la biomasa de cada Erlenmeyer completo por filtración usando membranas estériles de nitrato de celulosa de 47 mm de diámetro y 0,45 µm de tamaño de poros (Sartorius). La biomasa se determinó llevando a peso seco las membranas (24 h a 105 ºC), con las bacterias retenidas en la filtración. Se determinó la concentración de ácido remanente en el sobrenadante por espectrofotometría UV visible con azometina H. Se calcularon la velocidad específica de crecimiento (μ) y la velocidad específica de consumo de ácido bórico (qA) para ambas cepas en los diferentes medios y condiciones. También se observaron con el microscopio electrónico de barrido de bajo vacío (JEOL JSM ? 6480 LV, Thermo Electron), los cultivos puros de las cepas seleccionadas crecidas durante 72 h a 30 °C y 250 rpm en MM sin y con ácido bórico en concentraciones finales de 20 y 40 mM.Resultados:Ambas cepas, al crecer en presencia de ácido generaron EPS que enturbiaron los medios, tornándolos viscosos y difíciles de filtrar. Como las determinaciones de biomasa se realizaron por peso seco (los EPS no se separaron previa filtración), se registró un importante aumento en el peso seco de la masa recuperada. Tanto el crecimiento como la producción de los EPS, se vieron favorecidos en MM respecto a ES en presencia de ácido bórico.Dado que el EPS generado en presencia del ácido bórico no fue separado al momento de recuperar la biomasa, los valores calculados de μ y de qA fueron altos respecto a los controles sin ácido. El acusado valor de qA respecto del aumento de biomasa, hace pensar que el boro está siendo removido de alguna manera en los EPS. Las micrografías electrónicas revelaron los EPS observados en el crecimiento en medio líquido, en baja cantidad y adherido a las paredes de las células en el caso de la cepa 002, mientras que, en el caso de la cepa 048 se observó una gran cantidad de EPS que formó una matriz donde las células quedaron retenidas. Conclusiones: Las cepas aisladas crecieron en mayor o menor medida en Medio Mínimo y Extracto de Suelo, incluso en presencia de ácido bórico en concentraciones finales de 20 y 40 mM. Los parámetros cinéticos velocidad específica de crecimiento y velocidad específica de remoción de ácido bórico en medios líquidos (ES y MM) indicaron que ambas cepas revisten importancia en cuanto a la remoción de ácido bórico. La microscopía electrónica reveló que las cepas generaron EPS en presencia del ácido bórico, que actuarían como agentes ?entrampantes? del boro. Posteriores estudios permitirán dilucidar cuál es la función que cumple el boro en la formación y composición de los EPS generados.