Regulación de la expresión de un factor de transcripción WRKY que se induce bajo condiciones de estrés oxidativo

SCARPECI TE; ZANOR MI; CARRILLO N; VALLE EM

Buenos Aires

Congreso; BAIRESBIOTEC2005; 2005

REDBIO

IntroducciónEl estrés oxidativo se origina como consecuencia de un desbalance entre la generación y la eliminación de las especies reactivas del oxígeno (ERO) (Fridovich, 1999). Se encuentran dentro de las ERO el radical anión superóxido (O2.), el peróxido de hidrógeno (H2O2) y el radical hidroxilo (OH.), las cuales se producen por la predisposición del O2 a reducirse univalentemente. En plantas crecidas bajo condiciones normales los niveles de ERO son bajos, pero muchas situaciones ambientales adversas pueden llevar a un aumento de estos niveles. Si bien las ERO pueden representar una amenaza para la célula, también pueden actuar como señales para la activación de los genes involucrados en la defensa antioxidante. En experimentos previos hemos analizado el perfil global de expresión génica (22.745 genes) de Arabidopsis thaliana sometidas a estrés oxidativo, mediante genechips (Affymetrix) (Scarpeci et al. 2004). En este trabajo presentaremos un análisis de expresión temprana de uno de los genes originariamente clasificado como "no-conocido" en el mencionado perfil de expresión, ante diferentes tipos de estrés. MetodologíaMaterial Vegetal: plántulas de A. thaliana de 2 semanas fueron crecidas en tierra o en MS en cámara de crecimiento con 8/16 h oscuridad/luz (120 µE m-2 s-1 ) a 20/23 °C. Northern blot: se aisló ARN total de hojas y se procesó de acuerdo a Weigel y Glazebrook (2002). Transformación de A.thaliana: se empleó A.tumefaciens cepa GV3101 pMP90 y se utilizó la técnica "Floral dip". Tratamientos de estrés: plántulas flotando en una solución con metil viológeno (MV) 50 µM 2 h, H2O2 20 mM 2 h, NaCl 100 mM 4 h, Manitol 200 mM 4 h, elicitores (obtenidos a partir de celulasa aislada de T. viride) 2 h, ácido salicílico (AS) 2 mM 4 h.La detección de GUS se realizó de acuerdo a Weigel y Glazebrook (2002).Retardo en geles: se realizaron según se describe en Latchman (1992).Resultados y DiscusiónEl análisis del perfil global de expresión (http://gabi.rzpb.de/projects/Mapman/) de A .thaliana en etapas iniciales de estrés oxidativo mostró que 802 genes variaron >1.6 o <-1.6 (log2 de la relación tratamiento/control), de los cuales 377 no tenían función conocida y 60 eran factores de transcripción. Dentro del primer grupo identificamos un gen que por comparación de secuencias en bancos de datos resultó ser un factor de transcripción de la familia WRKY (Eulgem et al. 2000) que denominamos WRKY-T. Esta superfamilia presenta 74 miembros en plantas, se unen a la secuencia de ADN (T)TGAC(C/T) (W box) mediante un dominio que contiene la secuencia WRKYGQK seguido de un motivo dedos de Zn y son inducidos en respuesta a estreses bióticos y abióticos.En la Fig. 1 se muestra un análisis Northern blot de WRKY-T en hojas de A.thaliana tratadas con MV a distintos tiempos. Se observa claramente la inducción de WRKY-T a tiempos tempranos del tratamiento, corroborando los resultados previos. Para estudiar el patrón de expresión in vivo de WRKY-T, se aisló su promotor y se clonó corriente arriba del gen reportero GUS (WRKY::GUS). En la Fig. 2 se muestran los resultados de actividad GUS de hojas de plantas transformadas con WRKY::GUS y sometidas a distintos tratamientos. No se observa expresión de WRKY-T en condiciones normales de crecimiento (control). Ante tratamientos con agentes oxidantes (MV o H2O2), se observa claramente inducción en puntos específicos de la hoja. En presencia de elicitores o AS hay una expresión muy alta en toda la hoja mientras que con NaCl y Manitol solo se detecta actividad GUS en el sistema vascular.La funcionalidad de WRKY-T también fue corroborada in vitro mediante ensayos de unión en geles de retardo de la proteína recombinante (Wrec) con una región (30 pb) de la secuencia promotora de wrky-T que contiene dos cajas W (Wbox). En la Fig. 3 A se muestra la unión creciente de Wrec a Wbox con el aumento de la concentración de proteína. La especificidad de unión se comprobó por competencia de Wbox con las dos cajas W mutadas (mWbox) (Fig. 3 B). Se observa competencia sólo con Wbox, indicando que la unión Wrec-Wbox es específica.ConclusionesEl análisis Northern blot pone en evidencia que wrky-T es un gen que se induce rápidamente luego de comenzado el desafío oxidativo. Esto también se observa con el gen reportero GUS, en donde se detectó actividad en plantas transformadas con WRKY::GUS cuando las mismas fueron tratadas con MV. Por otro lado, este factor de transcripción se induce fuertemente por tratamiento con elicitores y AS aunque no con etileno (datos no mostrados). Estos datos estarían sugiriendo que el gen wrky-T estaría involucrado en una ruta de señalización AS-dependiente. Además, wrky-T se induce por estrés salino y osmótico, ambas situaciones también generadoras de ERO dentro de la célula. Todos estos resultados indicarían que WRKY-T estaría involucrado en distintas rutas de señalización tanto de estrés biótico como abiótico donde participan ERO.BibliografíaEulgem T, et al (2000). Trends Plant Sci. 5:199-206.Fridovich, I (1999). Ann.N.Y.Acad.Sci. 893:13-18.Latchman, DS (1992). In: Transcription factors: a practical approach, IRL Press, Oxford.Scarpeci et al  (2004). Biocell 28 (Suppl.) Abs. PL-S1.Weigel D, y Glazebrook J (2002). In: Arabidopsis: a laboratory Manual, CSHL Press.