Oclusión de calcio en la Bomba de Ca2+ de membrana plasmática

M. FERREIRA GOMES; MC DE LA FUENTE; RM GONZÁLEZ-LEBRERO; RC ROSSI; JPFC ROSSI

Los cocos, Córdoba, Argentina

Congreso; XXXVIII reunión anual de la Sociedad Argentina de Biofísica (SAB); 2009

Sociedad Argentina de Biofísica (SAB)

<!-- /* Style Definitions */ p.MsoNormal, li.MsoNormal, div.MsoNormal {mso-style-parent:""; margin:0cm; margin-bottom:.0001pt; mso-pagination:widow-orphan; font-size:12.0pt; font-family:"Times New Roman"; mso-fareast-font-family:"Times New Roman";} @page Section1 {size:612.0pt 792.0pt; margin:70.85pt 3.0cm 70.85pt 3.0cm; mso-header-margin:36.0pt; mso-footer-margin:36.0pt; mso-paper-source:0;} div.Section1 {page:Section1;} --> La bomba de Ca2+ de membrana plasmática (PMCA) es una proteína transmembrana esencial para el mantenimiento de la concentración de Ca2+  intracelular. Su ciclo de reacción involucra intermediarios fosforilados y transiciones conformacionales, tanto entre formas fosforiladas (E1P<->E2P) como desfosforiladas (E1<->E2). Se postula que la fosforilación de la enzima sería simultánea con la oclusión de Ca2+. El objetivo de este trabajo es identificar y caracterizar el intermediario ocluido de Ca2+, E1P (Ca2+). Para esto desarrollamos un procedimiento que permite medir la oclusión de Ca2+ en microsomas con PMCA. Esto incluye un sistema de sobreexpresión de la Ca2+-ATPasa y el uso de un aparato de mezclado rápido combinado con una cámara de filtrado, el cual permite el aislamiento de la enzima y la posterior cuantificación del 45Ca2+ retenido (CaR). Se realizaron medidas del CaR en estado estacionario en medios de reacción conteniendo concentraciones de Ca2+ que variaron entre 2 y 70 mM. Además, se incorporó alameticina, un péptido que forma canales en la membrana, lo que permitió anular la acumulación de 45Ca2+  dentro de las vesículas. Cuando el medio de reacción incluía ATP, el CaR fue mayor que en ausencia del nucleótido. La presencia de lantano, inhibidor que bloquea el cambio conformacional E1P -> E2P produciendo una acumulación de E1P, aumentó significativamente el CaR. Medidas de la cantidad de fosfoenzima en estas condiciones experimentales permitieron obtener una relación de ~1 mol CaR/mol de fosfoenzima. La cantidad de CaR, tanto en presencia como en ausencia de ATP, aumenta hiperbólicamente con la concentración de Ca2+ con valores de K0.5 cercanos a 8 mM. La presencia de calmodulina (CaM), activador específico de la PMCA, produjo un aumento del CaR sin modificar el valor de K0.5. Sin embargo, al menos parte de dicho aumento podría deberse a la unión de 45Ca2+ a la CaM y no a los sitios de transporte de la bomba. Estos resultados sugieren que el 45Ca2+ medido se encontraría ocluido en la PMCA. Con subsidios de ANPCYT, CONICET y UBACYT.