Confirmación de la relación entre la sensibilidad reducida a las equinocandinas en Candida guilliermondii y las mutaciones naturales M633 y A634 en Fks1p.

DUDIUK, CATIANA; LEONARDELLI, FLORENCIA; MACEDO, DAIANA; CABEZA, MATIAS; GAMARRA, SOLEDAD; GARCIA, GUILLERMO

Rosario

Congreso; CAM ALAM 2016 ? Congreso Argentino de Microbiología y Congreso Latinoamericano de Microbiología; 2016

Introducción: La mayoría de las candidiasis invasoras en nuestro país son causadas por Candida albicans, C. glabrata, C. parapsilosis y C. guilliermondii. Las equinocandinas son el tratamiento de elección para estas infecciones. Estos antifúngicos actúan sobre la pared celular fúngica inhibiendo el complejo 1,3-β-D-Glucan sintasa. Las subunidades catalíticas de este complejo son los blancos de las equinocandinas y son denominadas Fksp. Estas subunidades son codificadas por los genes homólogos FKS1, FKS2 y FKS3. Las mutaciones en la región hot spot de los Fksp (por ej. F641 y S645 en C. albicans) confieren resistencia clínica a las equinocandinas. C. parapsilosis y C. guilliermondii, presentan sensibilidad reducida natural a las equinocandinas. En la primera de estas especies, se comprobó molecularmente que una sustitución natural en Fks1p (A660) es la responsable de este fenotipo. C.guillermondii también presenta sustituciones naturales (M633 y A634) y sensibilidad reducida natural a las equinocandinas. Sin embargo, no hay estudios moleculares que relacionen esta característica genética con el fenotipo.Objetivo: Evaluar molecularmente la relación de las sustituciones naturales M633 y A634 del hot spot 1 de Fks1p de C.guilliermondii con el fenotipo de sensibilidad reducida natural a las equinocandinas.Materiales y Métodos: Se utilizaron las cepas C.guilliermondii ATCC 6260 y Saccharomyces cerevisie BY4742 (fks1∆453-649::URA3) como cepas parentales. Mediante un método de mutagénesis dirigida basado en PCR de fusión se generó un vector que incluye la región hot spot 1 del gen FKS1 de C. guilliermondii, flanqueado por partes del gen FKS1 de S. cerevisiae. Este vector se utilizó para transformar la cepa BY4742 por el método de acetato de litio y generar cepas de S. cerevisiae quiméricas que presente una proteína fks1p funcional con la región hot spot 1 de C. guilliermondii. La selección de mutantes se realizó utilizando Caspofungina (CSF). La evaluación de los transformantes se llevó a cabo por PCR (para confirmar la incorporación correcta del vector), secuenciación (para evaluar la secuencia incorporada) y por pruebas de sensibilidad a CSF siguiendo los protocolos de CLSI M27-S4 y M44-A2 (microdilución en placa y discos, respectivamente).Resultados: Se evaluó la sensibilidad a CSF de: S. cerevisie BY4742, C. guilliermondii ATCC 6260 y de 7 transformantes S. cerevisie quiméricos (fks1p-hotspot 1 de C. guilliermondii). Los valores de CIM obtenidos fueron: 0,0007 µg/ml, 0,25 µg/ml y 0,25 µg/ml, respectivamente. En el caso de las pruebas con discos los diámetros de inhibición fueron de: 20mm, 14mm y entre 13-15mm, respectivamente. Conclusiones: Mediante este trabajo se puede concluir que las sustituciones M633 y A634 presentes naturalmente en la región hot spot 1 del Fks1p de C. guilliermondii, son necesarias y suficientes para explicar el fenotipo de Sensibilidad Reducida Natural a las Equinocandinas.