ESTUDIO DE LA GLICOSILACIÓN DEL FLAGELO EN Ralstonia solanacearum Y SU ROL EN LA PATOGÉNESIS

M. L. TONDO; A. I. VANDECAVEYE; M. LANDONI; A. S. COUTO; E. G. ORELLANO

Congreso; XIX Congreso y la XXXVII Reunión Anual de la Sociedad de Biología de Rosario; 2017

La glicosilación de proteínas, la unión covalente de carbohidratos a residuos aminoacídicosespecíficos, constituye un mecanismo de modificación post-traduccional común enbacterias. Los glúcidos se encuentran generalmente unidos a proteínas de la superficiecelular, tales como las subunidades de las S-layers, el flagelo y el pili tipo IV, las cualesjuegan importantes roles en la interacción de bacterias patógenas con su organismohospedador. La adición de carbohidratos a la flagelina, subunidad estructural del flagelobacteriano, ha sido reportada en un gran número de bacterias Gram-negativas, siendo enmuchos casos requerida para el ensamblado, la estabilidad y funcionalidad del filamentoflagelar (motilidad). En el caso particular de bacterias patógenas se ha demostrado quejuega un rol esencial en la virulencia y en la evasión de la respuesta inmune delhospedador. Ralstonia solanacearum es una β-proteobacteria Gram-negativa del suelo queproduce la enfermedad conocida como ?marchitez bacteriana? en más de 200 especies deplantas, incluyendo numerosos cultivos de interés agronómico. Estudios in silico orientadosa identificar posibles genes involucrados en los mecanismos de glicosilación de R.solanacearum, revelaron la presencia de dos marcos abiertos de lectura que codifican paraproteínas hipotéticas con homología a glicosiltransferasas, RSp0387 y RSp0388, localizadosen estrecha proximidad con los genes del aparato flagelar. En el presente trabajo se evaluóla glicosilación de la proteína flagelina de R. solanacearum y se comenzó el estudiofuncional de los genes RSp0387 y RSp0388 por medio de la construcción y caracterizaciónde cepas mutantes deficientes en los mismos. Se realizaron aislamientos de flagelina apartir de cultivos de la cepa de R. solanacearum GMI1000; los extractos proteicosobtenidos se analizaron mediante SDS-PAGE y se identificó la banda correspondiente a laproteína bajo estudio mediante análisis por HPLC-ESI. La glicosilación de la flagelina secorroboró mediante tinción con PAS y posteriormente se caracterizó el patrón deglicosilación mediante espectrometría de masas (MS) y HPAEC-PAD, determinando lapresencia de N- y O-glicanos de entre 3 y 14 unidades de hexosa. Por otra parte, con elobjetivo de evaluar la función de los genes RSp0387 y RSp0388 se generaron cepasmutantes en los mismos, las cuales fueron caracterizadas fisiológicamente. Las cepasmutantes exhibieron cinéticas de crecimiento similares a la cepa salvaje en medio líquidoBG, y morfología de colonia normal en placas de agar suplementadas con cloruro detrifeniltetrazolio. Estudios de microscopía electrónica de transmisión revelaron que lascepas mutantes RSp0387 y RSp0388 se encuentran flageladas; sin embargo, las mismasexhiben reducida motilidad en medio líquido en comparación con la cepa salvaje, lo quesugiere que la función del flagelo estaría afectada por la ausencia de dichos genes.