High Resolution Melting (HRM) como nuevo método para la detección simultánea y discriminación de los Herpesvirus bovino tipo 1 (BoHV-1) y tipo 5 (BoHV-5)

MARIN M; QUINTANA S; LEUNDA MR; RECAVARREN M; PAGNUCO I; SPÄTH E; PÉREZ S; ODEÓN A

San Miguel de Tucumán

Otro; XX REUNIÓN CIENTÍFICO TÉCNICA ASOCIACIÓN ARGENTINA DE VETERINARIOS DE LABORATORIOS DE DIAGNÓSTICO; 2014

Introducción Los Herpesvirus bovino tipo 1 (BoHV-1) y tipo 5 (BoHV-5) son dos alfaherpesvirus estrechamente relacionados que infectan al ganado. Dada su gran similitud, su diferenciación no se logra mediante técnicas virológicas clásicas. Por lo tanto, los virus aislados y muestras obtenidas de animales afectados deberían analizarse mediante métodos moleculares sensibles y confiables. La técnica de High Resolution Melting (HRM) fue desarrollada recientemente como una extensión de los análisis de la curva de disociación (o "fusión") del ADN que se lleva a cabo en los aparatos de PCR en Tiempo Real convencionales. Se utiliza para caracterizar las muestras de ADN de acuerdo con su comportamiento de disociación en la transición a partir del ADN de doble cadena a ADN de cadena sencilla al aumentar la temperatura, lo cual es altamente dependiente de la secuencia de nucleótidos. Hasta el momento, esta metodología no había sido implementada para la identificación de los herpesvirus bovinos. El objetivo de este estudio fue desarrollar una técnica de PCR en Tiempo Real con análisis por HRM para la detección simultánea y diferenciación de BoHV-1 y BoHV-5. Materiales y Métodos Se extrajo el ADN total a partir de cepas de referencia de BoHV-1 (LA y Cooper) y de BoHV-5 (N569 y A663), 10 aislamientos argentinos de campo de BoHV-1 y 1 de BoHV-5, 5 muestras clínicas positivas por PCR convencional y 45 muestras del aparato respiratorio de animales infectados experimentalmente, utilizando un kit comercial (Qiagen Inc., Valencia, CA, USA). Para identificar los cebadores con mayor eficiencia, se evaluaron tres pares de cebadores. Las secuencias correspondientes al fragmento amplificado, fueron alineadas y comparadas con el programa MAFFT (Katoh y Standley, 2013). Las condiciones del ensayo fueron optimizadas utilizando diferentes concentraciones de cebadores, temperaturas y tiempos de annealing. Las amplificaciones de PCR en Tiempo Real se llevaron a cabo en un termociclador Rotor Gene Q, en un volumen final de 20 ul utilizando EvaGreen como intercalante fluorescente (KAPA HRM FAST, Biosystems, Woburn, USA). El programa de ciclado consistió en una desnaturalización inicial de 3 min a 95 °C y 50 ciclos de 15 s a 95 °C, 15 s a 58 °C y 20 s a 72 °C. Al finalizar la reacción se efectuó un análisis de la curva de HRM y la identificación del genotipo viral. La sensibilidad analítica y especificidad del ensayo fueron determinadas; asimismo, se comparó esta técnica con el aislamiento viral y PCR convencional (Campos et al., 2009) utilizando las muestras de aparato respiratorio. La concordancia entre las tres metodologías se evaluó mediante el coeficiente kappa de Cohen y la diferencia entre los coeficientes fue calculada mediante la prueba de Chi-cuadrado (P menor 0,05). Todos los análisis se realizaron con el software Epidat 3.0 (Hervada Vidal et al., 2004). Resultados y Discusión Los cebadores descriptos por Diallo et al. (2011) fueron seleccionados de acuerdo con la eficiencia de reacción y capacidad mayor para diferenciar entre BoHV-1 y BoHV-5. Dentro de las secuencias amplificadas, sólo 14 nucleótidos difirieron entre ambos virus. Fue posible obtener una estrategia de amplificación eficiente, una curva de fusión clara para diferenciar BoHV-1 y BoHV-5 y picos de fusión apropiados para ambos productos de PCR. Las temperaturas de melting (Tm) obtenidas para BoHV-1 y BoHV-5 fueron 89,7 y 91,1 °C, respectivamente. Estos resultados mostraron que los tipos de BoHV pueden distinguirse por el cambio característico de Tm en las curvas de fusión. Además, se obtuvieron picos de fusión distinguibles para cada tipo de BoHV al emplear una mezcla artificial del ADN de BoHV-1 y BoHV-5, confirmando que los cebadores seleccionados pueden diferenciar infecciones mixtas. El ADN de BoHV fue identificado en todos los aislamientos y muestras clínicas utilizadas cuando se evaluaron por la metodología de PCR en Tiempo Real-HRM, discriminando los tipos de BoHV adecuadamente. Con respecto a la detección en muestras respiratorias, se detectó el ADN de BoHV-1 en 12/18 muestras de terneros infectados por BoHV-1, incluyendo muestras de ganglios retrofaríngeos y bronquiales, epitelio de mucosa nasal, tráquea y bronquios y pulmones. El ADN de BoHV-5 fue detectado en 7/18 muestras de terneros infectados con BoHV-5, incluyendo ganglios retrofaríngeos y mediastínicos y epitelio de mucosa nasal, tráquea y bronquios. El ADN viral no se detectó en ninguna de las 9 muestras de animales control no infectados. La técnica desarrollada permitió la detección viral incluso a partir del ADN de 10 partículas virales y no se observó reacción cruzada. La tasa de detección obtenida con PCR en Tiempo Real-HRM fue mayor cuando se comparó con el aislamiento viral o PCR convencional. De 45 muestras del tracto respiratorio evaluadas, fue posible detectar el ADN viral en 19 muestras. Sin embargo, por PCR convencional fueron positivas 14 muestras y el virus infeccioso sólo se detectó en 5 muestras. El coeficiente de concordancia entre PCR en Tiempo Real-HRM y PCR convencional fue de 0,76, entre PCR en Tiempo Real-HRM y aislamiento viral fue de 0,29 y entre PCR convencional y aislamiento viral fue de 0,43. Se observaron diferencias significativas al comparar las tres técnicas entre sí (P menor 0,05). La técnica de PCR en Tiempo Real-HRM mostró la sensibilidad más alta en relación con las otras metodologías. Existe una necesidad de identificar correctamente los aislamientos de campo de BoHV para lograr un diagnóstico etiológico final preciso y comprender mejor su epidemiología y patogenia. En este estudio, la técnica de HRM se desarrolló como un nuevo procedimiento para el análisis y diferenciación de tipos de BoHV, tanto en cultivo viral como en muestras de tejido. Este método proporciona una detección rápida, sensible y específica del ADN de alfaherpesvirus bovinos. Además, demostró ser útil para la detección simultánea de dos tipos de herpesvirus. Por lo tanto, esta técnica constituye una herramienta de gran utilidad para estudios diagnósticos, de investigación y epidemiológicos de estos patógenos del ganado.