FUNCIÓN DE LOS DOMINIOS C2A Y C2B DE SYNAPTOTAGMINA VI EN LA EXOCITOSIS ACROSOMAL

CASTILLO BENNETT, JIMENA; ROGGERO, CARLOS MARCELO; DE BLAS, GERARDO ANDRES; TOMES, CLAUDIA N.; MAYORGA, LUIS S.

Mendoza

Jornada; VIII JORNADAS DE INVESTIGACIÓN DE LA FACULTAD DE CIENCIAS MÉDICAS, UNCuyo. Marzo 2005.; 2005

La reacción acrosomal (RA) es una exocitosis regulada, dependiente de calcio, que sufre el espermatozoide como proceso indispensable para la fecundación del ovocito. Durante la misma tiene lugar una cascada de transducción de señales, en la cual la proteína quinasa C (PKC) es un componente clave. Además se han involucrado en la exocitosis a las synaptotagminas (syt), atribuyéndoseles la función de sensores de calcio; cada una de esta gran familia de proteínas transmembranas posee dos dominios citosólicos de unión a calcio y fosfolipidos (C2A y C2B). Previamente demostramos que syt VI está presente en espermatozoides humanos y que su dominio citosólico (C2A+C2B) purificado inhibe la RA en espermatozoides humanos permeabilizados y este efecto es regulado por fosforilación. En este trabajo nos centramos en el estudio de la regulación por fosforilación de los dominios C2A y C2B y su interacción en la RA. Se observó que tanto el dominio C2A como C2B mostraron un efecto inhibitorio individual sobre la RA, y que este efecto fue anulado por la fosforilación in vitro mediada por PKCII de estos dominios. Buscando el sitio de fosforilación responsable de esta regulación hallamos, en el dominio C2B, una secuencia polibásica (KKKTTIK) clave para el funcionamiento de las syt, la cual sería también un blanco para PKC. Para corroborar esto, las T418 y T419 fueron mutadas a Ala (TA) para eliminar el sitio probable de fosforilación o a Glu (TE) para imitar la carga negativa introducida por el fosfato. Ambas mutantes fueron usadas en ensayos de RA observándose para la mutante TA un efecto inhibitorio no regulado por fosforilación, mientras que TE no inhibió. Resultados similares se obtuvieron cuando la Thr284 en la región polibásica del dominio C2A (KCKLQTR) fue mutada a Ala o Glu. Nuestros resultados son consistentes con la hipótesis que las regiones polibásicas de C2A y C2B de syt VI son sitios de fosforilación mediada por PKC en estos dominios y que la fosforilación de esta región regula la interacción de ambos dominios con la maquinaria de fusión que opera durante RA. Es importante destacar que estos residuos Thr están conservados en todas las syt identificadas al presente, sugiriendo que su fosforilación seria un evento clave en la regulación de la proteína.