LOCALIZACIÓN DE PROTEÍNAS POR MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE TRANSMISIÓN UTILIZANDO DOMINIOS POLI-CISTEÍNAS

ZANETTI N; MAYORGA LS

Mar del Plata

Congreso; Congreso Conjunto de Sociedades Biomédicas SAIC - SAI - SAFE - SAN - SABiología - SABiofísica - SAF; 2004

Sociedad Argentina de Investigación Clínica

Las proteínas para ser localizadas por microscopía de fluorescencia, deben ser unidas a anticuerpos acoplados a un fluorocromo o bien pueden ser fusionados a marcadores fácilmente detectables. Uno de los marcadores más utilizados es la Green Fluorescent Protein (GFP). La principal desventaja que GFP presenta es que no puede ser detectada microscopía electrónica. Hasta el momento no se han desarrollado marcas que permitan el seguimiento de una proteína por microscopía electrónica de transmisión (TEM) así como se logró con la GFP para microscopía de fluorescencia. Con este propósito, se decidió fusionar una proteína de interés a una secuencia aminoacídica específica, que posea alta afinidad por metales pesados, formando un complejo electrón-denso detectable por TEM. Una secuencia con estas características son los dominios poli-cisteínas, que presentan alta afinidad por Cu(2+). Para determinar la efectividad de este nuevo dominio como marcador proteico para TEM, se sintetizó un péptido poli-cisteína, el cual fue unido a IgG purificada utilizando un agente químico específico y posteriormente el dominio fue saturado con Cu(2+). El complejo IgG-péptido-Cu(2+) formado fue endocitado por macrófagos J774 por 10 minutos a 37°C y luego las células fueron procesadas siguiendo un protocolo de TEM convencional evitando la tinción de la muestra con uranilo y/o plomo. En cortes obtenidos de células incubadas con el complejo, se observó la presencia de marcas electrón-densas en el interior de vesículas periféricas que corresponderían al complejo IgG-péptido-Cu(2+). Estas marcas no se encontraron en otros compartimientos de las mismas células, ni tampoco en el control negativo. Los resultados obtenidos sugieren que este dominio poli-cisteínas permitiría localizar proteínas con alta resolución y especificad por TEM, por su capacidad de formar complejos electrón-densos con metales pesados.