Producción de la enzima alfa Galactosidasa A humana en medio libre de suero fetal bovino, purificación parcial y caracterización

MARÍA CELESTE RODRÍGUEZ; NATALIA CEAGLIO; CLAUDIO PRIETO; MARINA ETCHEVERRIGARAY

Cocoyoc, Morelos

Simposio; VII Simposio Latinoamericano de Tecnología de Cultivos Celulares (SLATCC); 2016

SLATCC

"La enfermedad de Fabry es una enfermedad recesiva asociada al cromosoma X que altera el catabolismo de los esfingolípidos debido a un déficit de la enzima alfa Galactosidasa A (EC 3.2.1.22). Este defecto conlleva una acumulación de esfingolípidos con residuos alfa-galactósidos terminales (Globotriaosilceramida) en el endotelio vascular de varios órganos como la piel, riñones, sistema nervioso y corazón. Desde el año 2001, la Terapia de Reemplazo Enzimático (TRE) está disponible para el tratamiento de esta enfermedad. Esta terapia consiste en la administración intravenosa de la enzima αGalA recombinante humana (rhαGalA) cada dos semanas. Agalsidase beta y agalsidase alfa son las dos presentaciones comerciales existentes hasta el momento. Se han descripto numerosas técnicas para maximizar los rendimientos y reducir los costos de producción de la enzima. La mayor productividad descripta hasta el momento es de 7,5 pg.cel-1.d-1, con una actividad enzimática in vitro de 13.000 UI.mg-1 en sobrenadante de cultivo de células CHO-K1.El presente trabajo describe la expresión de rhαGalA en células CHO-K1 adaptadas al crecimiento en suspensión en medio libre de suero empleando vectores lentivirales de tercera generación como sistema de transferencia génica, la purificación y la caracterización bioquímica parcial de la proteína. Mediante este sistema, se alcanzaron productividades entre 10 y 21 pg.cel-1.d-1, con valores de actividad enzimática específica in vitro superiores a lo reportado en sobrenadantes de cultivos. Posteriormente, la enzima rhαGalA sintetizada y secretada por las células productoras fue sometida a un proceso de purificación a partir de sobrenadante de cultivo. Se realizaron dos pasos de purificación: un primer paso de captura empleando una resina de intercambio aniónico débil y un segundo paso por interacción hidrofóbica. Luego del segundo paso de purificación, se alcanzó una pureza del 90% y una recuperación global del 76%, con un valor de actividad enzimática específica de 1,5*106 UI.mg-1, similar a la reportada para la molécula de referencia (2,0-3,5*106 UI.mg-1) (Selden et al., 2000).Para su aplicación como terapia de reemplazo enzimático, es esencial que la rhαGalA se dirija hacia los lisosomas de los tejidos afectados. La probabilidad de éxito de dirigirse a los tejidos blancos depende de la presencia de residuos de M-6-P terminales para promover la internalización por parte del receptor de M-6-P presente en los lisosomas, así como también de un elevado contenido de ácido siálico para aumentar la vida media en circulación. Por este motivo, la caracterización del perfil de glicosilación de la enzima es fundamental. El contenido de M-6-P de la enzima purificada fue exactamente igual al valor reportado para la molécula de referencia (3 moles de M-6-P por mol de proteína), mientras que el contenido de ácido siálico resultó aproximadamente 37% mayor que lo reportado para la molécula de referencia (10 moles de ácido siálico por mol de proteína frente a 7,3 moles de ácido siálico por mol proteína). Estos valores se correlacionan con lo obtenido mediante la técnica WAX-HPLC, mediante la cual se logró identificar un mayor contenido de glicanos cargados con respecto a los neutros, los cuales constituyeron sólo un 5% de los glicanos totales. Se observó un mayor contenido de glicanos de tipo bi- y tri-sialidados (43% y 18%, respectivamente) y un 13% de glicanos mono-fosforilados.Estos resultados en su conjunto representan un avance significativo en la tecnología de producción de la enzima rhαGalA logrando, mediante el empleo de vectores lentivirales, valores de productividad y actividad enzimática in vitro superiores a los reportados hasta el momento. Asimismo, la disponibilidad de la enzima en sobrenadante de cultivo en su forma activa y en altas concentraciones facilitó el proceso de downstream propuesto, lo que en consecuencia llevaría a una reducción de los costos totales de producción."