Desarrollo de una multiplex qPCR y pan-Dengue qPCR para la detección del virus Dengue

LUCAS RIPOLL; BORIO CRISTINA; DANIEL GHIRINGHELLI; BILEN, MF

Congreso; Congreso Argentino de Virología,; 2017

AAM

INTRODUCCIÓNEl Dengue (DENV) es una enfermedad endémica en Argentina con alta incidencia en países de la región (Paraguay, Bolivia Brasil).De acuerdo a la Organización Panamericana de la Salud, hasta diciembre del 2016 tan solo en Argentina se reportaron 41.211 casos confirmados de dengue.Las metodologías más utilizadas en la actualidad para la detección del DENV, se basan en métodos serológicos (ELISA), RT-qPCR, cultivo viral y ensayos de hemoaglutinación. La metodología gold standard es el cultivo del virus en células C6/36, pero la obtención de resultados es costoso y puede llevar hasta una semana. Otro método muy utilizado es PCR en tiempo real, debido a su sensibilidad y posibilidad de cuantificación. Sin embargo todos los sistemas disponibles son costosos e importados.Contar con un sistema de detección eficaz y desarrollado localmente puede contribuir al diagnóstico y monitoreo del virus en muestras naturales.OBJETIVODesarrollar y validar un sistema de detección de DENV basados en PCR en tiempo real multiplex serotipo específica y otro Pan-Dengue.METODOLOGÍA Y RESULTADOSA partir de una base de datos de secuencias genómicas del DENV se realizó un análisis bioinformático para diseñar primers y sondas para la detección de los cuatros serotipos existentes. Se desarrolló una mezcla de reacción ad hoc optimizada para cada sistema qPCR utilizando componentes de producción local. Posteriormente se validaron analíticamente cada sistema evaluando parámetros de especificidad, linealidad y límite de detección. Para la detección del virus a partir de muestras de mosquitos se diseñó un sistema Pan Dengue qPCR basados en moléculas intercalantes. Esta estrategia apunta a disminuir costos y contar con una herramienta de monitoreo general para la presencia del virus en poblaciones de mosquitos. El sistema presentó parámetros de linealidad (R2>0,97) entre 1600 ? 160000 moléculas y un límite de detección de 16 -1600 moléculas. Este sistema fue utilizado para detectar el virus en larvas de huevos recolectados en viviendas con personas infectadas, pero no se detectó la presencia del virus. Para la detección y serotipificación del DENV se desarrolló un sistema multiplex qPCR utilizando sondas de hidrólisis. A este sistema se le incorporó un control interno basado en un bacteriófago de ARN. Para evitar contaminaciones con ADN producto de reacciones previas, se sumó al sistema la enzima Uracil DNA glicosilasa (UDG) junto con dUTP?s en la mezcla de reacción. Este sistema presentó parámetros de linealidad (R2>0,98) entre 16 -160000 moléculas, un límite de detección de 16 -160 moléculas y 100 % especificidad entre serotipos. CONCLUSIÓNSe obtuvieron dos sistemas de qPCR con alta performance, que nos permitirán diagnosticar y monitorear la presencia del virus en muestras naturales, a un costo accesible y sin demoras de provisión. Esta plataforma sienta las bases para el desarrollo de otros sistemas de detección necesarios en nuestra sociedad.