Desarrollo de un sistema point of care para la detección de dengue

BERGIER JULIAN; DANIEL GHIRINGHELLI; BILEN MARCOS

Congreso; XII Congreso Argentino de Virología; 2017

AAM

INTRODUCCIÓNLos sistemas de detección de ácidos nucleicos son ampliamente utilizados en diferentes áreas debido a su sensibilidad especificidad y rapidez. Sin embargo, la mayoría de estos sistemas utilizan tecnologías asociadas a equipos sofisticados y costosos. En la actualidad existe un fuerte desarrollo de nuevos sistemas de detección rápidos, sensibles, y de bajo costo denominados (POCT). Estos sistemas, son particularmente útiles, cuando se requieren resultados inmediatos, por ejemplo en una epidemia, en lugares con escaso acceso a centros de salud o en zonas rurales alejadas de centros de alta complejidad.Una etapa en el proceso de detección de ácidos nucleicos es la amplificación de los mismos. Las metodologías más utilizadas se encuentran asociadas a la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Sin embargo existen otros tipos de tecnologías de amplificación isotérmicas más eficientes y económicas como RCA (), LAMP ().OBJETIVOEstudiar y evaluar la performance de una nueva metodología de amplificación isotérmica de ácidos nucleicos, acoplada a un dispositivo de detección .METODOLOGÍA Y RESULTADOSSe desarrolló una metodología de amplificación isotérmica que denominamos Easy Loop Amplification (ELA) la cual presenta ventajas respecto a LAMP y otras técnicas. Para evaluar su performance se utilizó al virus Dengue (DENV) como modelo de estudio. A partir del análisis bioinformático de genomas de DENV, se diseñaron serotipo específico para DENV 1. Se analizaron diferentes parámetros de reacción (temperatura, enzimas polimerasas, cofactores, oligonucléotidos) para estudiar la influencia de los mismos en la eficiencia del sistema. Posteriormente, se evaluó la especificidad del sistema utilizando secuencias genómicas de los cuatro serotipos virales. La metodología presentó 100% de especificidad en las condiciones ensayadas.Por otro lado, se evaluó la sensibilidad utilizando cantidades conocidas de moléculas de ADN ó ARN. Se logró detectar entre 300-600 moléculas molde.La visualización y/o detección de los productos amplificados se construyó un dispositivo POCT basado en la detección de una reacción colorimétrica acoplada a la amplificación del ADN. Paralelamente se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa y amplificación en tiempo real. CONCLUSIÓNTeniendo en cuenta las ventajas que presentan las metodologías de amplificación isotérmica, se desarrolló una nueva metodologías denominada ELA.Los resultados del estudio de los parámetros de reacción mostraron que esta metodología es altamente específica y sensible. Debido a la características de la amplificación fue posible acoplarla a una reacción colorimétrica que fue detectada mediante un dispositivo construido ad hoc. Este sistema podría ser utilizado para la detección de Dengue y otros patógenos de importancia sanitaria.